朱崢 張雷 徐濟(jì)責(zé)

(吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，吉林，132101)

責(zé)任編輯:潘 華。

紫丁香蘑(Lepista nuda)別名裸口蘑、紫晶蘑。隸屬擔(dān)子菌亞門(mén)(Basidiomycotina)、層菌綱(Hymenomycetes)、傘菌目(Agaricales)、白蘑科(Tricholomtaceae)、香蘑屬(Lepista (Fr)W.G.Sm.)。有記載顯示紫丁香蘑與松、榛、山楊等形成外生菌根，是森林生態(tài)系統(tǒng)的必要組成部分。該屬全世界已經(jīng)發(fā)現(xiàn)400 余種，除紫丁香蘑外，我國(guó)分布的主要種類(lèi)還有花臉蘑(Lepista sordida)、肉色香蘑(L.irima)、灰紫香蘑(L.glaucocana)等。該屬是擔(dān)子菌門(mén)中著名的食用兼藥用真菌，有學(xué)者從L.sordida 中分離的兩個(gè)萜類(lèi)化合物有一定的抗菌活性［1］，而且從L.sordida 菌絲體內(nèi)提取胞內(nèi)多糖具有很強(qiáng)的抗氧化活性［2］。高錦明等［3］對(duì)紫丁香蘑化學(xué)成分的研究首次從本屬真菌中獲得化合物I-III;李卓［4］對(duì)紫丁香蘑液體發(fā)酵海藻糖的提取純化進(jìn)行研究。對(duì)一些珍稀香蘑的人工培養(yǎng)及栽培生理方面的研究報(bào)道較少，人工栽培香蘑屬某些種還處于小規(guī)模試驗(yàn)階段，徐沖力等［5］對(duì)白香蘑菌絲培養(yǎng)條件及人工馴化栽培研究。姚志偉等［6］對(duì)紫丁香蘑原基誘導(dǎo)合成培養(yǎng)基初探。謝富剛等［7］對(duì)紫丁香蘑部分生物學(xué)特性進(jìn)行探討。趙婷等［8］對(duì)紫丁香蘑菌絲體培養(yǎng)特性試驗(yàn)結(jié)果表明:紫丁香蘑菌絲生長(zhǎng)的最佳碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽分別為蔗糖、酵母膏、硫酸鎂;菌絲生長(zhǎng)的最佳培養(yǎng)基配比為蔗糖20 g/L、酵母膏2 g/L、硫酸鎂0.5 g/L，菌絲干質(zhì)量達(dá)0.183 3 g。

雖有對(duì)紫丁香蘑進(jìn)行研究，但對(duì)采自山地向草原過(guò)渡帶特殊生態(tài)環(huán)境的野生紫丁香蘑相關(guān)研究未見(jiàn)報(bào)道。本研究從個(gè)體生態(tài)學(xué)角度系統(tǒng)研究其生物學(xué)特性，為林下經(jīng)濟(jì)開(kāi)發(fā)、菌根植物經(jīng)營(yíng)、真菌區(qū)系多樣性的研究提供參考。

1 材料與方法

菌株來(lái)源:菌株(Lepista nuda)采自吉林左家自然保護(hù)區(qū)，菌株編號(hào)為2014005。

培養(yǎng)基為PDA 加富培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蛋白胨4 g，磷酸二氫鉀3 g，硫酸鎂1.5 g，瓊脂粉20 g，蒸餾水1 L，pH 值自然。

溫度試驗(yàn):以加富培養(yǎng)基為標(biāo)準(zhǔn)，分別設(shè)置15、20、25、30、35 ℃5 個(gè)不同溫度處理，將15 mL 加富PDA 培養(yǎng)基倒入直徑90 mm 的平板中，冷卻，無(wú)菌條件下接入直徑0.5 cm 的平板培養(yǎng)物［9］。每個(gè)處理5 次重復(fù)，接種后分別置于15、20、25、30、35 ℃5個(gè)不同溫度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。接種后定時(shí)觀察記錄菌絲的生長(zhǎng)速度，菌絲長(zhǎng)勢(shì)，菌絲顏色，菌落邊緣特征等性狀。待接種一周后，測(cè)量平板中菌絲的半徑，計(jì)算出菌絲的日均長(zhǎng)速，數(shù)據(jù)采用Spss18.0 軟件中Duncan 檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析。

pH 值試驗(yàn):以加富培養(yǎng)基為標(biāo)準(zhǔn)，分別設(shè)置4、5、6、7、8 共5 個(gè)不同pH 值處理，培養(yǎng)基配制、接種、培養(yǎng)、數(shù)據(jù)觀測(cè)、記錄以及數(shù)據(jù)的分析方法同溫度試驗(yàn)。

不同碳源試驗(yàn):分別用蔗糖、果糖、乳糖、麥芽糖、淀粉、玉米粉、葡萄糖7 個(gè)不同碳源替代PDA 加富培養(yǎng)基中的葡萄糖，培養(yǎng)基配制、接種、培養(yǎng)、數(shù)據(jù)觀測(cè)、記錄以及數(shù)據(jù)分析方法同溫度試驗(yàn)。

不同氮源試驗(yàn):分別用蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、尿素、硝酸銨5 個(gè)不同氮源替代PDA 加富培養(yǎng)基中的蛋白胨，培養(yǎng)基配制、接種、培養(yǎng)、數(shù)據(jù)觀測(cè)、記錄以及對(duì)數(shù)據(jù)分析方法同溫度試驗(yàn)。

不同單色光(晝夜交替)試驗(yàn):以加富培養(yǎng)基為標(biāo)準(zhǔn)，分別設(shè)置白光、紅光、藍(lán)光、綠光、黃光5 個(gè)不同晝夜交替光照處理，培養(yǎng)基配制、接種、培養(yǎng)、數(shù)據(jù)觀測(cè)、記錄以及對(duì)數(shù)據(jù)分析方法同溫度試驗(yàn)。

不同單色光(持續(xù)照射)試驗(yàn):以加富培養(yǎng)基為標(biāo)準(zhǔn)，分別設(shè)置白光、紅光、藍(lán)光、綠光、黃光5 個(gè)不同持續(xù)光照處理，培養(yǎng)基配制、接種、培養(yǎng)、數(shù)據(jù)觀測(cè)、記錄以及數(shù)據(jù)分析方法同溫度試驗(yàn)。

不同無(wú)機(jī)鹽試驗(yàn):分別用硫酸鐵、硫酸鈣、硫酸鎂、硫酸鋅、硫酸銅5 個(gè)不同無(wú)機(jī)鹽替代PDA 加富培養(yǎng)基中的硫酸鎂，培養(yǎng)基配制、接種、培養(yǎng)、數(shù)據(jù)觀測(cè)、記錄以及數(shù)據(jù)分析方法同溫度試驗(yàn)。

不同維生素試驗(yàn):以加富培養(yǎng)基為標(biāo)準(zhǔn)，分別設(shè)置VB1、抗壞血酸、VB2、VB6、葉酸5 個(gè)不同維生素處理，培養(yǎng)基配制、接種、培養(yǎng)、數(shù)據(jù)觀測(cè)、記錄以及對(duì)數(shù)據(jù)分析方法同溫度試驗(yàn)。

正交試驗(yàn):在以上8 個(gè)試驗(yàn)結(jié)果后，采用7 因素兩水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)L8(25)見(jiàn)表1，篩選pH 值、溫度、碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽、單色光(晝夜交替)、維生素等最優(yōu)組合，見(jiàn)表1。

表1 7 因素兩水平正交試驗(yàn)

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

試驗(yàn)菌株在不同溫度下的生長(zhǎng)情況見(jiàn)表2。在20 和25 ℃時(shí)，菌絲長(zhǎng)勢(shì)良好，在20 ℃時(shí)，菌絲生長(zhǎng)最快，長(zhǎng)勢(shì)最好，日均長(zhǎng)速達(dá)到3.309 6 mm，隨著溫度升高，菌絲生長(zhǎng)速度減慢，長(zhǎng)勢(shì)變?nèi)酰虼?，該菌株菌絲生長(zhǎng)的最適溫度為20 ℃。研究結(jié)果與謝富剛等［7］的研究結(jié)果相吻合。經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)證明低溫對(duì)菌絲體的生長(zhǎng)有一定促進(jìn)作用，也由此證明該菌株溫型為低溫型，可能該屬溫型與地理隔離關(guān)系不大。

表2 不同溫度條件下菌絲生長(zhǎng)情況

2.2 pH 值對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

試驗(yàn)菌株在不同pH 值下的生長(zhǎng)情況見(jiàn)表3，試驗(yàn)菌株在pH 值5.0～8.0 的范圍內(nèi)均能生長(zhǎng)，但不同pH 值下菌絲的生長(zhǎng)狀況有較大差異，在pH 值為6.0 時(shí)菌絲長(zhǎng)勢(shì)最好，長(zhǎng)速最快，日均長(zhǎng)速達(dá)到3.666 7 mm。當(dāng)pH 值高于和低于6 時(shí)菌絲生長(zhǎng)速度開(kāi)始減慢，因此該菌株菌絲生長(zhǎng)的最適pH 值為6.0，這與大多數(shù)大型真菌對(duì)pH 值的要求相一致，均為中性偏酸。

表3 不同pH 值條件下菌絲生長(zhǎng)情況

2.3 碳源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

試驗(yàn)菌株在不同碳源下的生長(zhǎng)情況見(jiàn)表4，試驗(yàn)菌株對(duì)碳源的選擇性廣泛，但菌絲生長(zhǎng)速度存在較大差異，其中以麥芽糖做碳源時(shí)菌絲長(zhǎng)速最快，長(zhǎng)勢(shì)最好，日均長(zhǎng)速達(dá)到3.488 1 mm，明顯優(yōu)于其它碳源，而淀粉和蔗糖次之，果糖最差。分析其原因，可能是麥芽糖提供更多的醛糖和酮糖，且與試驗(yàn)菌株自身酶系和酶的調(diào)節(jié)利用相關(guān)，從而利于該菌株的糖代謝，本研究結(jié)果與申慧彥等［10］對(duì)花臉香蘑(lepista sordida)的胞外酶活性的研究結(jié)果相吻合;其中玉米粉條件下菌絲生長(zhǎng)情況優(yōu)于果糖，其原因是玉米粉除了能提供碳源外，還能提供一些氮源和一些其它天然成分，促進(jìn)菌絲的生長(zhǎng)。通過(guò)研究發(fā)現(xiàn):供試菌株的最適碳源為麥芽糖，其次是淀粉，研究結(jié)果與趙婷等［8］紫丁香蘑菌絲體培養(yǎng)特性試驗(yàn)的研究結(jié)果有異，經(jīng)過(guò)反復(fù)試驗(yàn)本研究結(jié)果仍成立。

表4 不同碳源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響結(jié)果

2.4 氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

試驗(yàn)菌株在不同氮源下的生長(zhǎng)情況見(jiàn)表5。試驗(yàn)菌株對(duì)氮源選擇性廣泛，但菌絲的生長(zhǎng)速度存在較大差異，其中以牛肉膏做氮源時(shí)菌絲長(zhǎng)速最快，長(zhǎng)勢(shì)最好，日均長(zhǎng)速達(dá)到5.690 4 mm，明顯優(yōu)于其它氮源，蛋白胨次之，之后依次為尿素、硝酸銨、酵母膏。該菌株利用有機(jī)氮優(yōu)于無(wú)機(jī)氮，對(duì)銨態(tài)氮的利用優(yōu)于硝態(tài)氮，硝酸銨是試驗(yàn)菌株不能很好利用的氮源，可能是因?yàn)殇@根離子濃度過(guò)高抑制菌絲的生長(zhǎng)，因此，供試菌的最適氮源為牛肉膏，其次是蛋白胨。

表5 不同氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響結(jié)果

2.5 單色光對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響(晝夜交替)

試驗(yàn)菌株在不同單色光照下的生長(zhǎng)情況見(jiàn)表6。不同的光照對(duì)供試菌株菌絲生長(zhǎng)的作用效果不同，但菌絲生長(zhǎng)速度存在較大差異，其中以紅光照射時(shí)菌絲長(zhǎng)速最快，長(zhǎng)勢(shì)最好，日均長(zhǎng)速達(dá)到2.797 6 mm;藍(lán)光和綠光次之。朱堅(jiān)等［11］對(duì)不同顏色薄膜套袋對(duì)金針菇生長(zhǎng)發(fā)育的影響研究表明紅光在金針菇的菌絲生長(zhǎng)階段有促進(jìn)作用，在誘導(dǎo)子實(shí)體發(fā)生階段，藍(lán)光有一定的刺激作用。這個(gè)結(jié)論能不能適合所有大型真菌需要更多基礎(chǔ)研究去驗(yàn)證。通過(guò)本研究發(fā)現(xiàn)以上幾種單色光中紅光對(duì)試驗(yàn)菌株的菌絲體生長(zhǎng)階段有刺激作用。因此，供試菌株的最適光照為紅光晝夜交替照射。

表6 不同光照條件下菌絲生長(zhǎng)情況

2.6 單色光對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響(持續(xù)照射)

試驗(yàn)菌株在不同光照下的生長(zhǎng)情況見(jiàn)表7，菌絲在單色光晝夜交替條件的生長(zhǎng)情況明顯優(yōu)于在單色光持續(xù)照射條件下，不同光質(zhì)對(duì)菌絲生長(zhǎng)影響也不同，在持續(xù)黃光照射時(shí)菌絲長(zhǎng)速最快，長(zhǎng)勢(shì)最好，日均長(zhǎng)速達(dá)到0.734 mm，白光和綠光次之，推測(cè)持續(xù)照射條件下可能對(duì)菌絲生長(zhǎng)有一定的抑制作用。

表7 不同單色光照射下菌絲生長(zhǎng)情況

2.7 無(wú)機(jī)鹽對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

試驗(yàn)菌株在不同無(wú)機(jī)鹽下的生長(zhǎng)情況見(jiàn)表8。在培養(yǎng)基中添加硫酸鈣和硫酸鎂對(duì)菌絲生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，可能因?yàn)殒V對(duì)糖代謝中許多酶類(lèi)發(fā)揮活性有一定的促進(jìn)作用，鈣能使菌株挺立，增加莖稈硬度;而硫酸銅和硫酸鋅對(duì)試驗(yàn)菌株菌絲生長(zhǎng)無(wú)明顯變化，可能與添加的無(wú)機(jī)鹽添加終濃度有關(guān);硫酸鐵對(duì)菌絲的生長(zhǎng)具有一定的抑制作用，可能與添加的量有關(guān)或者與該菌株中無(wú)機(jī)物對(duì)代謝有反饋調(diào)節(jié)。

2.8 維生素對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

試驗(yàn)菌株在不同維生素下的生長(zhǎng)情況見(jiàn)表9。在培養(yǎng)基中添加一定量維生素對(duì)菌絲生長(zhǎng)有一定的促進(jìn)作用。其中，添加VB1 的長(zhǎng)勢(shì)最好，日均長(zhǎng)速達(dá)0.425 mm，抗壞血酸和VB6 次之。VB1 參與糖代謝中的脫羧和轉(zhuǎn)酮作用，VB6 更多的參與氨基酸代謝，從而有利于菌絲的生長(zhǎng)。

表8 不同無(wú)機(jī)鹽條件下菌絲生長(zhǎng)情況

表9 不同維生素對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響結(jié)果

2.9 正交試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)按照7 因素2 水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)，數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明，影響紫丁香蘑菌絲生長(zhǎng)因素的由大到小順序?yàn)樘荚础囟?、pH 值、維生素、氮源、無(wú)機(jī)鹽、單色光，通過(guò)正交試驗(yàn)極差分析可知:C 因素(碳源)對(duì)菌絲生長(zhǎng)影響最大，F(xiàn) 因素(單色光)對(duì)菌絲生長(zhǎng)影響最小。由此可得:紫丁香蘑菌絲生長(zhǎng)的最優(yōu)組合條件以麥芽糖、20 ℃、pH 值6.0、VB1、牛肉膏、硫酸鎂、藍(lán)光為最佳。

3 結(jié)論與討論

對(duì)生物學(xué)特性的研究可以得到以下結(jié)論:該菌株最適生長(zhǎng)溫度為20 ℃，最適pH 值為6.0，最適碳、氮源分別為麥芽糖和牛肉膏，在菌絲生長(zhǎng)過(guò)程中施加合適的光照能讓菌絲更好地生長(zhǎng)，添加一定量的硫酸鎂和VB1 對(duì)菌絲生長(zhǎng)有一定的促進(jìn)作用;菌絲體最佳生長(zhǎng)條件為麥芽糖、20 ℃、pH 值6.0、VB1、牛肉膏、硫酸鎂、藍(lán)光。

紫丁香蘑為中低溫型食藥兼用外生菌根真菌，在20 ℃時(shí)生長(zhǎng)最快，因此，在北方野生紫丁香蘑大都發(fā)生在春、秋兩季;且與多數(shù)大型真菌一樣適合在中性偏酸環(huán)境下生長(zhǎng);在最佳碳源的利用上與趙婷等研究結(jié)果有異，這可能與地理隔離有關(guān)。通過(guò)試驗(yàn)，篩選出適合菌絲生長(zhǎng)的各因素，并對(duì)其進(jìn)行正交試驗(yàn)，確定最優(yōu)組合，通過(guò)菌絲的培養(yǎng)使其侵染外生菌根植物，保證植物對(duì)水分及其它礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)的吸收與利用，為森林培育提供參考。同時(shí)，從個(gè)體生態(tài)學(xué)角度研究特殊地域的野生大型真菌菌株，為真菌區(qū)系多樣性提供參考。

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