趙金玲 姚文靜 王升級(jí) 姜廷波 周博如

(林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(東北林業(yè)大學(xué))，哈爾濱，150040)

責(zé)任編輯:潘 華。

楊樹(shù)(Populus trichocarpa)既是廣泛應(yīng)用的綠化樹(shù)種，也是生產(chǎn)紙漿材和一些木材產(chǎn)品的用材樹(shù)種［1］。楊樹(shù)的的基因組測(cè)序于2006年完成并公布。楊樹(shù)以其生長(zhǎng)速度快、遺傳轉(zhuǎn)化容易，使其成為研究植物抗旱、耐鹽、抗低溫等非生物脅迫的木本模式植物。在脅迫條件下，許多功能基因和調(diào)控基因被誘導(dǎo)表達(dá)，各種抗逆相關(guān)蛋白大量積累［2-3］。過(guò)量表達(dá)滲透復(fù)合物合成酶基因、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因、活性氧清除劑基因可明顯提高轉(zhuǎn)基因植物的抗旱性［4］。轉(zhuǎn)錄因子與其下游基因順式結(jié)合元件結(jié)合，調(diào)控目標(biāo)基因的表達(dá)，在應(yīng)答環(huán)境脅迫中起著關(guān)鍵作用［5-8］。在擬南芥和水稻基因組各含有約1 300～1 600 的基因編碼的轉(zhuǎn)錄因子。植物中轉(zhuǎn)錄因子按照其結(jié)構(gòu)域的不同可分為MIKC、C2H2、WRKY、bZIP、MYB、SBP、HB、GATA、EIL、NAC 和AP2/ERF 等若干個(gè)家族。研究表明，過(guò)量表達(dá)應(yīng)答逆境脅迫的轉(zhuǎn)錄因子基因，可以促進(jìn)其下游抗逆相關(guān)基因的表達(dá)，提高轉(zhuǎn)基因植物的抗脅迫能力［9-12］。AP2/ERF 基因家族是植物所特有的一類轉(zhuǎn)錄因子家族之一，含有一個(gè)或兩個(gè)保守的AP2/ERF 結(jié)構(gòu)域［13-14］?？梢酝ㄟ^(guò)結(jié)合脫水應(yīng)答元件DRE 和CRT 以應(yīng)答干旱、低溫、高鹽脅迫［13］，通過(guò)與GCC-box 及誘導(dǎo)元件結(jié)合應(yīng)答脅迫［15］。當(dāng)前，有關(guān)木本植物AP2/ERF 基因家族成員的功能分析研究還較少，本文利用生物信息學(xué)的方法分析楊樹(shù)AP2/ERF 基因家族成員系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)、保守結(jié)構(gòu)域、蛋白質(zhì)理化性質(zhì)、以及蛋白質(zhì)二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)等，為進(jìn)一步研究楊樹(shù)轉(zhuǎn)錄因子功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫(kù)中楊樹(shù)AP2/ERF 轉(zhuǎn)錄因子家族的搜索

從楊樹(shù)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/)中得到210 條楊樹(shù)AP2/ERF 轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白的氨基酸序列，從擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.arabidopsis.org/)中得到146 條AP2/ERF 轉(zhuǎn)錄因子家族的氨基酸序列。

1.2 分析方法

利用ClustalW 對(duì)210 個(gè)楊樹(shù)AP2/ERF 轉(zhuǎn)錄因子家族家族蛋白和146 個(gè)擬南芥AP2/ERF 轉(zhuǎn)錄因子家族家族蛋白的氨基酸序列進(jìn)行序列比對(duì)，默認(rèn)參數(shù)設(shè)置。然后利用MEGA 6.0 構(gòu)建鄰接樹(shù)(NJ)，設(shè)置Bootstrap 為1000 次重復(fù)。

利用MEME 數(shù)據(jù)庫(kù)(http://meme-suite.org/)提供的在線檢索服務(wù)對(duì)楊樹(shù)AP2/ERF 轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白氨基酸序列的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析。

根據(jù)楊樹(shù)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)，確定210 個(gè)AP2/ERF 轉(zhuǎn)錄因子家族基因在19 條楊樹(shù)染色體上的分布情況。

用ExPaSy 提供的在線Protparam 軟件(http://web.expasy.org/protparam/)進(jìn)行氨基酸數(shù)目、分子量、理論等電點(diǎn)、脂肪族氨基酸數(shù)和蛋白質(zhì)疏水性分析。

利用DNAMAN6.0 軟件預(yù)測(cè)210 條楊樹(shù)AP2/ERF 轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，并利用Swiss-Model 程序?qū)?5 個(gè)亞族中隨機(jī)取的15 條蛋白進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)同源建模。

2 結(jié)果與分析

2.1 楊樹(shù)AP2/ERF 轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白的分類

根據(jù)AP2/ERF 超家族蛋白氨基酸序列的相似性和AP2/ERF 結(jié)構(gòu)域數(shù)量，將210 條楊樹(shù)AP2/ERF 轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白和146 條AP2/ERF 轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白分為AP2、ERF、DREB 和RAV 亞家族等4 個(gè)亞家族及其他(Potri.002G246100)(表1)。AP2 亞家族蛋白含有兩個(gè)重復(fù)的AP2/ERF 結(jié)構(gòu)域，在調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起著十分重要的作用［16-18］;ERF 亞家族和DREB 亞家族蛋白含有一個(gè)單一的AP2/ERF 結(jié)構(gòu)域［19］，這兩個(gè)亞家族的主要區(qū)別在AP2/ERF 結(jié)構(gòu)域的第14 位和第19 位氨基酸殘基，ERF 亞家族是丙氨酸和天冬氨酸，而DREB 亞家族第14 位和第19 位氨基酸分別是纈氨酸和谷氨酸［19］。DREB 亞家族成員可以識(shí)別干旱和冷誘導(dǎo)響應(yīng)元件(DRE/CRT，A/GCCGAC)，在植物抵抗非生物脅迫過(guò)程中起著非常重要的作用［20-21］。ERF 亞家族成員可以識(shí)別GCC 盒(AGCCGCC)，在植物抵抗生物脅迫過(guò)程中發(fā)揮重要的作用［22］。RAV 亞家族蛋白含有一個(gè)AP2/ERF 域和一個(gè)B3 域，在乙烯響應(yīng)［23］、油菜素內(nèi)酯響應(yīng)［24］、生物和非生物脅迫響應(yīng)［25］過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。

表1 楊樹(shù)和擬南芥AP2/ERF 轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白基本概況

2.2 楊樹(shù)AP2/ERF 轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)構(gòu)建

利用ClustalW 對(duì)210 個(gè)楊樹(shù)AP2/ERF 轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白和146 個(gè)擬南芥AP2/ERF 轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白的氨基酸序列進(jìn)行序列比對(duì)(如圖1)。參照擬南芥分類方法將210 個(gè)楊樹(shù)AP2/ ERF 轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白分為DREB、ERF、AP2、RAV 等4 個(gè)亞家族，有一個(gè)蛋白單獨(dú)分為一類。其中，DREB 亞家族蛋白可進(jìn)一步分為6 個(gè)亞類分別為A1、A2、A3、A4、A5、A6;ERF 家族蛋白進(jìn)一步也可分為6 個(gè)亞類分別為B1、B2、B3、B4、B5、B6。該結(jié)果與擬南芥AP2/ERF 家族蛋白的分類情況類似［19］，說(shuō)明楊樹(shù)與擬南芥的AP2/ERF 轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白的氨基酸序列之間雖有差異但也存在較高的保守性。

2.3 AP2/ERF 轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白保守結(jié)構(gòu)域

高度保守的AP2/ERF 結(jié)構(gòu)域是AP2/ERF 家族蛋白的重要特征。AP2/ERF 家族蛋白的其他結(jié)構(gòu)域在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中也起很重要的作用。為確定不同結(jié)構(gòu)域中氨基酸的保守程度，利用MEME 數(shù)據(jù)庫(kù)提供的在線檢索服務(wù)對(duì)所有楊樹(shù)AP2/ERF 蛋白的氨基酸序列進(jìn)行分析，結(jié)果表明在AP2/ERF 結(jié)構(gòu)域在AP2/ERF 家族蛋白中保守程度最高，而其他結(jié)構(gòu)域的保守程度依不同的亞類有所不同。在相同的亞類中除AP2/ERF 結(jié)構(gòu)域保守性最高外，還存在一個(gè)或幾個(gè)相對(duì)保守的其他結(jié)構(gòu)域，這些相對(duì)保守結(jié)構(gòu)域成為AP2/ERF 家族蛋白進(jìn)一步分為不同亞族和和不同亞類的重要依據(jù)。在AP2/ERF 家族蛋白的相同亞族或相同亞類中，由于具有相同或相似的一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)域，使其在順勢(shì)作用元件結(jié)合、蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間相互作用中可能表現(xiàn)出類似的功能。

圖1 楊樹(shù)與擬南芥AP2/ERF 轉(zhuǎn)錄因子系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)

2.4 楊樹(shù)AP2/ERF 轉(zhuǎn)錄因子家族基因物理定位

楊樹(shù)AP2/ERF 基因在19 條染色體組上均有分布，但呈不均勻分布。位于1 號(hào)染色體上的AP2/ERF 基因最多，共有27 個(gè)基因;位于9 號(hào)染色體上的AP2/ERF 基因最少，只有2 個(gè)基因。不同亞家族AP2/ERF 基因在楊樹(shù)染色體上也呈不均勻分布，ERF 亞家族基因多數(shù)在1 號(hào)染色體上分布最多，共有16 個(gè)基因;而在6、16、18 號(hào)染色體上沒(méi)有分布。DREB 亞家族基因在6 號(hào)染色體上分布最多，共有14 個(gè)基因，在第11 號(hào)染色體上沒(méi)有分布。AP2 亞家族基因的分布比較分散，但在第4、9、11、12、13、15、19 號(hào)染色體上沒(méi)有分布。RAV 基因僅存在于3、6、8、10、18 號(hào)等5 條染色體上。單獨(dú)基因Potri.002G246100 分布在第2 號(hào)染色體上。不同基因分布的染色體不同，其表達(dá)水平也可能不同。

2.5 楊樹(shù)AP2/ERF 轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白質(zhì)理化性質(zhì)

不同AP2/ERF 家族蛋白的氨基酸組成成分及理化性質(zhì)不同，組成蛋白質(zhì)的氨基酸數(shù)目在不同亞族之間差異較大。其中，AP2 亞族的平均氨基酸數(shù)目最多為504 個(gè)，DREB 亞族的平均氨基酸數(shù)目最少為248 個(gè)?？傮w看毛果楊A(yù)P2/ERF 家族蛋白質(zhì)分子中富有含酸性氨基酸，蛋白的等電點(diǎn)大多數(shù)在酸性范圍內(nèi)，只有RAV 亞族的理論等電點(diǎn)大多在堿性范圍內(nèi)。脂肪系數(shù)即脂肪族氨基酸指數(shù)，該指數(shù)可以作為標(biāo)定蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的一個(gè)指標(biāo)，即脂肪族氨基酸指數(shù)高者蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性高?？傮w來(lái)說(shuō)AP2/ERF 家族的蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性較高，RAV 亞家族的平均熱穩(wěn)定性最高，ERF-B4 組的平均熱穩(wěn)定性最低。不同亞族氨基酸序列間的疏水性(GRAVY值)雖存在差異，但均為負(fù)值，表明均屬于親水性蛋白(表2)。

2.6 AP2/ERF 轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析

蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)指它的多肽鏈中有規(guī)則重復(fù)的構(gòu)象，二級(jí)結(jié)構(gòu)主要有α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲。利用DNAMAN6.0 軟件預(yù)測(cè)210 條楊樹(shù)AP2/ERF 家族蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示全部AP2/ERF 家族蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)都以隨機(jī)卷曲為主(圖2)。

蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)是指球狀蛋白質(zhì)的多肽鏈在二級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上相互配置而形成特定的構(gòu)象。本研究利用Swiss-Model 程序?qū)?5 個(gè)亞族中隨機(jī)取的15 條蛋白進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)同源建模，結(jié)果顯示同屬ERF 亞族和DREB 亞族蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)總體相似，差異不明顯。而AP2、RAV 和其他等3 個(gè)亞族蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)則各具特點(diǎn)，差異較大(圖3)。主要表現(xiàn)在有些蛋白質(zhì)的α-螺旋、β-折疊和無(wú)規(guī)則卷曲的長(zhǎng)度都不同，可能會(huì)造成空間角度的不同，從而使它們的功能也有所不同。

表2 楊樹(shù)AP2/ERF 家族蛋白理化性質(zhì)

續(xù)(表2)

續(xù)(表2)

續(xù)(表2)

圖2 楊樹(shù)AP2/ERF 轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

圖3 AP2/ERF 蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

3 結(jié)論與討論

轉(zhuǎn)錄因子在植物的生長(zhǎng)發(fā)育及應(yīng)答外界環(huán)境變化過(guò)程中起著重要的調(diào)控作用，是調(diào)節(jié)各種生理活動(dòng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。近年來(lái)，人們從植物中分離出許多調(diào)控干旱、高鹽、低溫、激素、病原反應(yīng)及發(fā)育相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，有些轉(zhuǎn)錄因子過(guò)量表達(dá)可以增強(qiáng)植物對(duì)逆境脅迫的抵抗能力和適應(yīng)能力［26-27］。AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族是植物特有的一類龐大的基因家族，家族成員之間的功能存在冗余，如何從已經(jīng)測(cè)序的物種中篩選和鑒定出人們需要的抗逆基因具有一定的難度［28］。

楊樹(shù)和擬南芥的AP2/ERF 轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白的氨基酸序列之間雖有差異但也存在較高的保守性。依據(jù)含有AP2/ERF 結(jié)構(gòu)域的數(shù)量及序列相似性均可以分為5 個(gè)亞家族，分別是AP2、ERF、DREB和RAV 及其他。210 個(gè)楊樹(shù)AP2/ERF 轉(zhuǎn)錄因子均具有1～2 個(gè)AP2/ERF 結(jié)構(gòu)域，其中的Gly-4、Arg-6、Glu-16、Trp-28、Leu-29、Gly-30 和Ala-38高度保守［13］。在對(duì)AP2/ERF 轉(zhuǎn)錄因子家族的AP2/ERF 結(jié)構(gòu)域高度保守，其他結(jié)構(gòu)域的保守程度依不同的亞類有所不同。但所有楊樹(shù)AP2/ERF 轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白均含有結(jié)構(gòu)域2、3、4、5 或6 中的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域，這些主要結(jié)構(gòu)域可能在調(diào)節(jié)AP2/ERF 蛋白質(zhì)的表達(dá)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。比較AP2/ERF 轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)楊樹(shù)AP2/ERF 家族成員蛋白質(zhì)分子量介于11.01～53.12 ku，理論等電點(diǎn)分布介于4.62～10.25，多數(shù)蛋白表現(xiàn)偏酸性，平均值達(dá)到6.68。在對(duì)其他理化性質(zhì)分析時(shí)發(fā)現(xiàn)疏水性雖存在差異，但均為負(fù)值，表明均屬于親水性蛋白。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明，楊樹(shù)AP2/ERF 轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)都以隨機(jī)卷曲為主，在對(duì)15 個(gè)亞族中隨機(jī)取的15 條蛋白進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)同源建模，發(fā)現(xiàn)同一亞家族中各個(gè)組的蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)差異不明顯，而不同亞家族之間的差異較大，由于空間角度的不同，可能使不同亞家族的成員之間具有不同的功能。蛋白質(zhì)二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)等預(yù)測(cè)表明，亞類之間的AP2/ERF 轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白的結(jié)構(gòu)極為相似的，表明其有可能起著相近的生物學(xué)功能，但其在楊樹(shù)中的具體功能還需要通過(guò)基因克隆及表達(dá)分析來(lái)驗(yàn)證。

AP2/ERF 轉(zhuǎn)錄因子家族基因中蘊(yùn)含著許多抗逆關(guān)鍵基因，本研究以擬南芥AP2/ERF 轉(zhuǎn)錄因子家族基因?yàn)閰⒖?，通過(guò)生物信息學(xué)方法分析楊樹(shù)AP2/ERF 基因家族的結(jié)構(gòu)特征，有利于人們對(duì)該轉(zhuǎn)錄因子家族的了解，為進(jìn)一步篩選和利用優(yōu)良抗逆AP2/ERF 轉(zhuǎn)錄因子基因提供分類依據(jù)，為進(jìn)一步研究該家族基因的功能提供參考。

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