胡錦興 彭德虎 梁小朋 羅立全 林 媛 蔡瓊娣 羅 煒 林兆原

(廣州市胸科醫(yī)院肺外結核八內科，廣東 廣州 510095)

·論著·

慢性缺氧對大鼠肺靜脈平滑肌細胞內鈣離子濃度的影響

胡錦興*彭德虎 梁小朋 羅立全 林 媛 蔡瓊娣 羅 煒 林兆原

(廣州市胸科醫(yī)院肺外結核八內科，廣東 廣州 510095)

目的:探索原代培養(yǎng)肺動脈高壓模型大鼠肺靜脈平滑肌細胞(PVSMCs)是否具有血管平滑肌功能及L型電壓依賴性鈣通道(VDCC)阻斷劑硝苯地平對其細胞內鈣離子濃度([Ca2+]i)的影響，為慢性缺氧性肺動脈高壓發(fā)病機制的研究提供理論依據(jù)。方法：用顯微鏡操作和膠原酶消化法分離、培養(yǎng)肺動脈高壓模型大鼠肺靜脈平滑肌細胞，鑒定培養(yǎng)的細胞及計算純度，利用細胞內鈣離子濃度檢測系統(tǒng)觀察慢性缺氧對PVSMCs靜息[Ca2+]i的影響及硝苯地平的干預作用。結果：該方法培養(yǎng)的肺動脈高壓模型造模的PVSMCs呈典型的平滑肌特性，表現(xiàn)為“峰-谷”狀生長，免疫化學α-Actin鑒定顯色，而且培養(yǎng)純度達到98%；慢性缺氧能使PVSMCs的靜息[Ca2+]i從(104.3±7.9) nmol/L提高到(197.9±11.8) nmol/L(P<0.05)；5 mmol/L的硝苯地平能完全阻斷慢性缺氧PVSMCs的[Ca2+]i對高鉀溶液的反應。結論：慢性缺氧可使PVSMCs的靜息[Ca2+]i升高，其機制可能與激活PVSMCs的VDCC導致細胞外Ca2+內流有關。

肺靜脈平滑肌細胞；慢性缺氧；硝苯地平；細胞內鈣離子濃度

肺動脈高壓(pulmonary hypertension，PH)是大部分慢性阻塞性肺疾病(COPD)最終發(fā)展成為肺心病而死亡的主要原因，PH的發(fā)病機制十分復雜，經過幾十年的研究，人們認識肺高壓的特點就是血管重構和肺血管平滑肌中Ca2+穩(wěn)態(tài)改變，細胞內Ca2+在血管平滑肌細胞的收縮和增生的復雜機制中起至關重要的作用[1]。研究表明，急性缺氧能導致肺靜脈收縮，而慢性低氧也能導致肺靜脈血管重塑[2-4]。另外，肺靜脈同肺動脈及毛細血管網(wǎng)一樣是形成肺循環(huán)阻力的主要部分之一，缺氧情況下下肺靜脈血管阻力改變也會影響肺循環(huán)阻力，進而影響肺動脈壓力[5-6]。本研究通過原代培養(yǎng)大鼠遠端肺靜脈平滑胎細胞(pulmonary venous smooth muscle cells,PVSMCs),借助熒光顯微鏡及細胞內鈣離子濃度檢測系統(tǒng)觀察慢性缺氧對大鼠遠端PVSMCs的[Ca2+]i影響，從而初步探索慢性缺氧導致肺靜脈重塑的可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 清潔級SD雄性大鼠，體質量200～250 g,由廣東省實驗動物中心提供。

1.1.2 主要試劑和儀器 體式顯微鏡(日本 Nikon SMZ1000),0.1 mm直頭顯微鑷、0.3 mm彎頭顯微鑷、0.15 mm顯微剪(上海金鐘)，倒置相差顯微鏡(德國 Leica),激光掃描共聚焦顯微鏡(日本 Nikon),Ⅰ型膠原酶、木瓜酶、牛血清白蛋白(BSA)、Triton X-100、小鼠抗大鼠平滑肌α-actin單克隆一抗、硝苯地平、NaCl、KCl、KH2PO4、MgSO4(美國Sigma),PBS、DMEM培養(yǎng)基、Ham′S F-12、胎牛血清(美國 Gibco),CyTM3偶聯(lián)山羊抗小鼠IgG二抗(美國 Jackson ImmunoResearch),細胞核熒光染料YO-PRO-1、Fura-3 AM(美國 Invitrogen), PClamp軟件記錄(美國Axon公司)。

1.2 方法

1.2.1 肺動脈高壓模型建立與鑒定 密閉缺氧箱內放置2個氧濃度探測器，控制N2閥門，控制箱內氧濃度在10%，一旦氧濃度高于10%，氮氣閥門自動打開灌入氮氣，平衡箱內氧濃度。同時向缺氧箱持續(xù)泵入空氣，一方面防止氧濃度過低，另一方面用以維持正常的CO2濃度，減少CO2對實驗結果的影響。隨機選取10只健康SD大鼠放入缺氧箱內3周作為缺氧組，每周更換鼠籠1次并補充飼料和水，同種同齡雄性鼠在正常條件下飼養(yǎng)作為對照組。飼養(yǎng)3周后處死，剪下右心室，左心室、分離室間隔稱重，測右心室/(左心室+室間隔重量)[RV/(LV+S)]。缺氧組右心室/(左心室+室間隔重量)為0.512±0.053，與對照組的0.343±0.048比較，差異有統(tǒng)計學意義，說明造模成功。

1.2.2 大鼠遠端肺靜脈平滑肌細胞原代培養(yǎng) 稱量SD大鼠，按50 mg/kg腹腔注射苯巴比妥鈉麻醉大鼠后，剪開胸腔，迅速離斷并取出心臟和左右肺,浸入預冷的2 mmol/L Ca2+HBSS溶液中,解剖顯微鏡下用顯微鑷、剪分離出各葉肺靜脈，去除血管外膜黏附的結締組織和脂肪組織，縱向剪開血管，用棉簽輕拭血管內表面以去除內皮細胞。將分離出的肺靜脈置于2 mmol/L Ca2+HBSS溶液中，冰上放置45 min，然后轉移到20 μM Ca2+HBSS溶液中室溫放置20 min。加入2.5 mL消化液并置于37 ℃消化23 min，注意消化時切勿密閉試管，消化至21 min時可取出觀察消化程度以及時按情況調節(jié)消化時間。將1.5 mL消化液倒入10 mL Ca2+HBSS液中終止消化。小心取出血管，置于1 mL過濾的無 Ca2+HBSS液中，用切去箭頭的l mL槍頭小心輕柔吹散消化過的血管，約25～35次，鏡下觀察吹打是否合適及完全，制成細胞懸液以5×107/L-1接種于6孔板中的載玻片(使用前100%酒精擦拭，過火，紫外照射15 min)中央，靜置20 min。小心加入2 mL Ham′SF-12+0.5%胎牛血清培養(yǎng)基，置于37 ℃和5%的CO2孵箱，12 h后換成含10%DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)5～6 d，實驗前12 h又換成Ham′SF-12+0.5%胎牛血清培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h。

1.2.3 細胞形態(tài)學觀察PVSMC 應用倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)、大小及生長特點。

1.2.4 免疫熒光法鑒定PVSMC 使用平滑肌α-actin單克隆抗體對培養(yǎng)的細胞進行鑒定，吸除細胞培養(yǎng)基，用PBS清洗2次后，多聚甲醛固定15 min,PBS清洗3次，每次2 min,5%BSA室溫封閉30 min，加1∶400稀釋的小鼠抗大鼠平滑肌α-actin單克隆一抗，濕盒內40℃過夜，陰性對照組加入PBS代替一抗，PBS清洗3次，每次5min,再加入1∶500 CyTM3偶聯(lián)山羊抗小鼠IgG二抗室溫避光孵育2 h，PBS清洗3次，每次5 min,加入3.5 μL/mL的YO-PRO-A液體室溫避光1 min，用50%緩沖甘油封片后激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察。

1.2.5 PVSMC細胞內[Ca2+]i的檢測 用可以透過細胞膜的Ca2+敏感的熒光染料Fura-3 AM檢測PVSMC細胞內[Ca2+]i，F(xiàn)ura-3 AM溶解于20%普朗尼克酸溶液的DMSO中。室溫下，細胞在Tyrode溶液中用Fura-3 AM(終濃度為5 μmol/L)負載40 min后，用Tyrode溶液充分沖洗細胞外Fura-3 AM，室溫靜置20min，使胞質中染料完全脫脂。關閉顯微鏡可視燈，打開熒光比/成像系統(tǒng)，設置激發(fā)波長為480 nm，發(fā)射波長為 535 nm，采樣時間為 35 ms/s，記錄時間為 45 min。高速熒光光源輸出激發(fā)光(波長 480 nm)，激發(fā)光經倒置顯微鏡的超級熒光型油鏡后，作用于PVSMCs，產生的發(fā)射光經帶通濾鏡(535/40 nm)后，由光-電倍增管(PMT)輸入計算機，熒光信號比率(F/F0)經PClamp軟件記錄與分析。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結 果

2.1 細胞生長的形態(tài)學鑒定

在倒置相差顯微鏡下觀察，剛消化下來并種植的細胞呈圓形或長圓形、透亮及大部分單個均勻分布，1 h后大部分可以貼壁，慢慢恢復長梭形，1 d后觀察，細胞展開，少量未貼壁細胞上浮死亡，見圖1A；3 d后觀察，細胞貼壁生長良好，呈現(xiàn)長梭形為主，細胞中間凸起的部分含有細胞核, 見圖1B；4～6 d細胞彼此交織成網(wǎng)狀, 見圖1C；7 d后細胞上滿整個培養(yǎng)皿的底面，呈長梭形，表現(xiàn)出典型的“峰-谷”狀生長,見圖1D。

BACD

注：A:酶消化后1 d展開的細胞；B:3 d后細胞呈長梭形；

C:5 d后細胞交織成網(wǎng)；D:7 d后細胞“峰-谷”狀生長

圖1 倒置相差顯微鏡下觀察肺動脈高壓模型

大鼠遠端PVSMCs(×100)

2.2 細胞熒光免疫法鑒定PVSMC培養(yǎng)細胞

在激光掃描共聚焦顯微鏡下，培養(yǎng)細胞對平滑肌α-actin免疫熒光顯色呈陽性反應，細胞質中填滿了典型的、平行排列的、紅色熒光顯色的平滑肌α-actin蛋白，見圖2A。在沒有用一抗孵育的對照組細胞，呈陰性反應，見圖2B。

BA

圖2 肺動脈高壓模型大鼠遠端PVSMCs α-actin免疫熒光染色(400×)

2.3 慢性缺氧對PVSMCs的細胞內靜息Ca2+濃度的影響

常氧組肺靜脈平滑肌細胞靜息鈣離子濃度為(104.3±7.9) nmol/L，而慢性缺氧性肺動脈高壓組肺靜脈平滑肌細胞靜息鈣離子濃度為(197.9±11.8) nmol/L，兩組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.4 硝苯地平對KCl誘導PVSMC細胞內[Ca2+]i升高的影響

KCl組細胞先用Tyrode溶液孵育5 min,換用100 nmol/L KCl溶液孵育細胞后，PVSMCs的[Ca2+]i從(203.6±10.8) nmol/L升高到(290.5±6.5) nmol/L(P<0.05)，△[Ca2+]i達到(83.4±9.8)nmol/L；10 min后，再改用Tyrode溶液孵育細胞，PVSMCs的[Ca2+]i逐漸恢復。硝苯地平干預組PVSMCs的[Ca2+]i的△[Ca2+]i僅僅是(8.4±1.5) nmol/L，與KCl組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖3。

350300250200150KCl(100mmol/L)[Ca2+]i(nmol/L)Nifedipine(5μmol/L)+KCl(100mmol/L1015202505t/min12080400KClNifediping組△[Ca2+]i(nmol/L)AB

注：A:兩組引起的鈣離子信號變化；B：兩組鈣離子變化的絕對值；與KCl組比較，*P<0.05

圖3 硝苯地平阻斷高鉀對慢性缺氧大鼠遠端PVSMCs的[Ca2+]i的影響

3 討 論

PH是由不同發(fā)病機制引起的，以肺動脈壓力超過一定界值為特征的多種疾病所共有的一組臨床病理生理綜合征[7-8]。慢性缺氧引起肺血管重塑是PH發(fā)病的主要環(huán)節(jié)之一，不僅發(fā)生在肺動脈，也包括肺靜脈[8]。因此，本實驗采用顯微鏡及酶消化法原代培養(yǎng)慢性肺動脈高壓模型大鼠遠端PVSMCs培養(yǎng)獲得的細胞 “峰-谷”狀生長，具有典型的平滑肌細胞形態(tài)學特性。平滑肌α-actin蛋白是血管平滑肌表達的特征蛋白，國內外文獻多有報道[9]。本實驗培養(yǎng)的PVSMCs免疫熒光可見細胞內大量肌絲，且平滑肌純度達到98%，運用該細胞探討了慢性缺氧對其[Ca2+]i的影響及可能機制。

L-型電壓依賴性鈣通道是血管平滑肌廣泛存在的一種鈣通道，基礎狀態(tài)下，各種鈣通道介導鈣內流維持血管基礎張力，如電壓依賴性鈣通道(L-VDCC)、鈣池操縱性鈣通道(SOCC)及受體操縱性鈣通道(ROCC)等[10-11]。

本研究結果顯示，慢性缺氧可導致PVSMCs靜息[Ca2+]i的升高，盡管靜息[Ca2+]i的升高需要細胞外鈣離子的內流，但是，硝苯地平可以完全抑制KCL誘導的[Ca2+]i的升高，確對靜息[Ca2+]i不產生影響，這表明PVSMCs靜息[Ca2+]i的升高主要通過非L型依賴的鈣離子通道途徑激活。有許多研究表明，暴露于慢性缺氧可使肺血管平滑肌細胞去極化[12-13]，我們推測，慢性缺氧導致PVSMCs靜息[Ca2+]i的升高進而激活L型鈣離子通道，從而使PVSMCs去極化，產生一系列的電生理反應。慢性缺氧激活大鼠遠端PVSMCs的非L型依賴的鈣通道的具體機制尚有待進一步研究。

綜上所述，本研究培養(yǎng)所獲得的PVSMCs不僅具有典型的血管平滑肌細胞形態(tài)學和免疫學結構特征，同時表現(xiàn)出良好的血管平滑肌細胞生理功能；慢性缺氧能引起PVSMCs靜息[Ca2+]i的升高，其可能是通過非L型依賴的鈣離子通道途徑激活，提示慢性缺氧引起的PVSMCs[Ca2+]i的升高在肺靜脈重塑過程中可能發(fā)揮獨特作用

[1] Wang J, Weigand L, Lu W, et al. Hypoxia inducible factor 1 mediates hypoxia-induced TRPC expression and elevated intracellular Ca2+in pulmonary arterial smooth muscle cells[J]. Circ Res,2006,98(12):1528-1537.

[2] Wagenvoort CA, Wagenvoort N. Pulmonary venous changes in chronic hypoxia[J]. Virchows Arch A Pathol Anat Histol,1976,372(1):51-56.

[3] Takahashi H, Soma S, Muramatsu M, et al. Upregulation of ET-1 and its receptors and remodeling in small pulmonary veins under hypoxic conditions[J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol,2001,280(6):L1104-L1114.

[4] Uzun O, Tuncay DA. Involvement of tyrosine kinase pathway in acute hypoxic vasoconstriction in sheep isolated pulmonary vein[J]. Vascul Pharmacol,2003,40(3):175-181.

[5] Schindler MB, Hislop AA, Haworth SG. Postnatal changes in pulmonary vein responses to endothelin-1 in the normal and chronically hypoxic lung[J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol,2007,292(5):L1273-L1279.

[6] Gao Y, Raj JU. Role of veins in regulation of pulmonary circulation[J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol,2005,288(2):L213-L226.

[7] Liu C, Chen J, Gao Y, et al. Endothelin receptor antagonists for pulmonary arterial hypertension[J]. Cochrane Database Syst Rev,2013,2(10):D4434.

[8] 陳 芳, 湯 彥. 肺動脈高壓的發(fā)病機制、治療進展[J]. 中華生物醫(yī)學工程雜志, 2006, 12(1): 80-84.

[9] Cairrao E, Santos-Silva AJ, Alvarez E, et al. Isolation and culture of human umbilical artery smooth muscle cells expressing functional calcium channels[J]. In Vitro Cell Dev Biol Anim,2009,45(3-4):175-184.

[10] Lin MJ, Leung GP, Zhang WM, et al. Chronic hypoxia-induced upregulation of store-operated and receptor-operated Ca2+channels in pulmonary arterial smooth muscle cells: a novel mechanism of hypoxic pulmonary hypertension[J]. Circ Res,2004,95(5):496-505.

[11] Liu XR, Zhang MF, Yang N, et al. Enhanced store-operated Ca(2)+ entry and TRPC channel expression in pulmonary arteries of monocrotaline-induced pulmonary hypertensive rats[J]. Am J Physiol Cell Physiol,2012,302(1):C77-C87.

[12] Peng W, Michael JR, Hoidal JR, et al. ET-1 modulates KCa-channel activity and arterial tension in normoxic and hypoxic human pulmonary vasculature[J]. Am J Physiol,1998,275(4 Pt 1):L729-L739.

[13] Shimoda LA, Sylvester JT, Sham J S. Chronic hypoxia alters effects of endothelin and angiotensin on K+currents in pulmonary arterial myocytes[J]. Am J Physiol,1999,277(3 Pt 1):L431-L439.

(本文編輯:歐陽菁)

Effect of chronic hypoxia on intracellular calcium ion concentration in rat pulmonary venous smooth muscle cells

HuJinxing,PengDehu,LiangXiaopeng,LuoLiquan,LinYuan,CaiQiongdi,LuoWei,LinZhaoyuan

(DepartmentofExtra-pulmonaryTuberculosis,GuangzhouChestHospital,Guangzhou510095,China)

Objective:To determine whether the primary culture of pulmonary venous smooth muscle cells (PVSMCs) from rats with pulmonary hypertension exhibit functions of vascular smooth muscles, and effect of L-type voltage-dependent Ca2+channel (VDCC) antagonist nifedipine on intracellular calcium ion concentration of PVSMCs, so as to provide scientific evidence for research on pathogenic role of chronic hypoxia in development of pulmonary hypertension. Methods: Microscopic operations and collagenase digestion were performed to isolate and culture the PVSMCs from rat model of chronic hypoxia. The PVSMCs were identified and studied for the purity of cultured cells. The effects of chronic hypoxia on resting [Ca2+]iin PVSMCs and the interventional role of nifedipine were examined with InCyte [Ca2+]imeasurement system. Results: The PVSMCs from rat model of pulmonary hypertension showed typical features of smooth muscles as reflected by “peak and trough” growth pattern and positive immunohistochemical staining of α-actin. The purity of PVSMCs reached 98%. Resting [Ca2+]iin PVSMCs was significantly elevated to (197.9±11.8) nmol/L from 104.3±7.9 nmol/L by chronic hypoxia (P<0.05).5mmol/L Nifedipine was shown to completely block the PVSMC [Ca2+]iresponse to KCL. Conclusion: Chronic hypoxia increases the resting [Ca2+]iin rat PVSMCs probably via activation of VDCC in PVSMCs which in turn results in influx of extracellular Ca2+.

pulmonary venous smooth muscle cells; chronic hypoxia; nifedipine; intracellular Ca2+concentration

10.3969/j.issn.2095-9664.2015.04.002

胡錦興(1980-)，男，博士，主治醫(yī)師。

R543.2

A

2095-9664(2015)04-0005-04

2015-02-17)

研究方向：肺動脈高壓及肺結核疾病。

*通訊作者：E-mail:hujinxing2000@163.com