呂情花

追風(fēng)透骨膠囊中馬兜鈴酸A的限量檢查

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目的完善追風(fēng)透骨膠囊中馬兜鈴酸A的限量檢查。方法用Waters C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)色譜柱檢測馬兜鈴酸A, 流動相：乙腈-0.4%冰醋酸(30∶70), 流速：1.00 ml/min, 檢測波長∶393 nm。結(jié)果用本法測定10批不同批號的追風(fēng)透骨膠囊, 均能準(zhǔn)確的判斷為未檢出馬兜鈴酸A。結(jié)論本法結(jié)果準(zhǔn)確, 可完善追風(fēng)透骨膠囊中馬兜鈴酸A的限量檢查。

高效液相色譜法；追風(fēng)透骨膠囊；馬兜鈴酸A；限量檢查

追風(fēng)透骨膠囊為國家食品藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)收載的品種[1]。由制川烏、細(xì)辛、地龍等二十四味中藥組成, 具有通經(jīng)絡(luò)、祛風(fēng)濕、鎮(zhèn)痛祛寒等功效。用于風(fēng)寒濕痹、四肢痹痛、手足麻木等。標(biāo)準(zhǔn)中用高效液相色譜法(HPLC法)測定馬兜鈴酸A的限量, 但在試驗中發(fā)現(xiàn), 該試驗條件下有其他物質(zhì)的干擾, 影響結(jié)果的判斷。追風(fēng)透骨膠囊屬國家基本藥物,國家食品藥品監(jiān)督管理總局每年都會對每一種基本藥物進行監(jiān)督抽查檢驗, 如果標(biāo)準(zhǔn)方法存在問題, 那勢必會造成錯誤的結(jié)論。因此, 本文改變了一些實驗條件, 排除其他物質(zhì)的干擾, 更能準(zhǔn)確的反映藥品的質(zhì)量。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥 Waters e2695 HPLC色譜儀, METTLER TOLEDO XS205十萬分之一天平；水為Ⅰ級純化水, 乙腈為色譜純, 其他試劑均為分析純。馬兜鈴酸A對照品購自中國藥品生物制品檢定所(批號：110746-200806)10批追風(fēng)透骨膠囊由湖南省回春堂藥業(yè)有限公司提供, 批號分別為20130514；20130305；20130308；20121213；20140521；20141203；20131108；20130206；20140409；20140709。

1.2 試驗方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)方法

1.2.1.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗 以碳十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料, 以乙腈-0.4%冰醋酸(35：65)為流動相,流速：1.00 ml/min, 檢測波長393 nm, 理論板數(shù)按馬兜鈴酸A峰計應(yīng)＞5000, 分離度＞1.5。

1.2.1.2 對照品溶液 精密稱取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥至恒重的馬兜鈴酸A對照品約9 mg, 加甲醇約90 ml, 超聲處理5 min使溶解, 放冷, 加甲醇稀釋至100.00 ml, 搖勻, 再精密量取2 ml, 加甲醇稀釋至50.00 ml, 搖勻, 即得。

1.2.1.3 供試品溶液 精密取供試品細(xì)粉10 g, 置250 ml圓底燒瓶中, 加甲醇約80 ml回流提取1 h, 濾過, 殘渣加甲醇20 ml洗滌, 濾過, 合并濾液, 水浴蒸干, 殘渣加0.1 mol/L氫氧化鈉溶液20 ml分次溶解洗滌, 轉(zhuǎn)入分液漏斗中, 再加氯仿40 ml分次溶解洗滌, 轉(zhuǎn)入分液漏斗中, 靜置使分層, 分取堿水層, 氯仿液再加0.1 mol/L氫氧化鈉溶液萃取4次,20 ml/次,棄去氯仿液, 合并堿水層, 再加5 mol/L鹽酸溶液20 ml, 加氯仿萃取5次,20 ml/次, 合并氯仿液, 加20 ml水洗2次, 氯仿液水浴蒸干, 殘渣加甲醇溶解稀釋至5 ml, 搖勻, 即得。標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定應(yīng)不得檢出馬兜鈴酸A。

1.2.2 試驗中發(fā)現(xiàn)的問題 用Waters C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)分離, 照上述試驗條件, 取上述對照品及供試品溶液各10.00 μl進樣, 色譜圖中, 在馬兜鈴酸A峰保留時間附近, 分離出3個峰, 且其中1個峰與馬兜鈴酸A峰保留時間一致,不借助DAD檢測器提取的峰光譜圖或質(zhì)譜檢測儀進行區(qū)別,結(jié)果無法判斷。其他色譜條件不變, 改用Gemini C18色譜柱、Shimadzu C18色譜柱及迪馬鉆石C18柱(規(guī)格均為4.6 mm×250 mm,5 μm)三種不同廠家的色譜柱, 結(jié)果均只有2個峰,且保留時間與馬兜鈴酸A不一致。

1.2.3 原標(biāo)準(zhǔn)方法系統(tǒng)適用性驗證 本文對原方法做了精密度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性等試驗, 結(jié)果表明試驗用的高效液相色譜儀和色譜柱均穩(wěn)定, 對照品溶液和樣品溶液均穩(wěn)定, 供試品的提取處理重現(xiàn)性好。但需分離物質(zhì)對色譜柱有一定的選擇, 待兩種物質(zhì)有的色譜柱能將其分開, 有的則不行。且分離開后, 應(yīng)對流動相的比例進行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。

2 結(jié)果

2.1 調(diào)整流動相 本文嘗試改變流動相, 分別以甲醇-3%冰醋酸(68:32)[2], 甲醇-3%冰醋酸(35:65)[3], 乙腈-0.5%冰醋酸(40:60)[4], 乙腈-甲醇-1%冰醋酸溶液(15:15:70)[5],乙腈-0.4%冰醋酸(30:70)為流動相, 流速1.00 ml/min, 以Waters C18柱、Gemini C18柱、Shimadzu C18柱及Dikma 鉆石C18柱(規(guī)格均為4.6 mm×250 mm,5 μm)進行分離測定, 結(jié)果以流動相乙腈-0.4%冰醋酸(30:70), Waters C18柱分離測定結(jié)果最好。見圖1。同時測定10批樣品, 結(jié)果均為未檢出,重現(xiàn)性好, 準(zhǔn)確度高。

2.2 改用二極管陳列檢測器 原標(biāo)準(zhǔn)的色譜條件, 用Waters C18柱分離得到的色譜圖中可疑峰保留時間雖然與馬兜鈴酸A保留時間接近, 但通過提取兩者光譜圖比較, 可疑峰光譜圖和對照品并不一致, 這樣也能判斷為未檢出馬兜鈴酸A。光譜圖見圖2。

圖1 色譜圖

圖2 光譜圖

3 討論

3.1 根據(jù)參考文獻和實驗, 供試品的制備：經(jīng)甲醇提取、堿化后用氯仿除去雜質(zhì)、酸化后氯仿提取, 用甲醇溶解定容,可消除其他物質(zhì)對馬兜鈴酸A的干擾[3]。

3.2 因本實驗室不具有質(zhì)譜檢測儀, 所以未用LC/MS法來鑒別。如果有質(zhì)譜檢測儀, 可以通過液質(zhì)聯(lián)用法做出更準(zhǔn)確的定性。有文獻記載[6]LC/MS法的測定條件：流動相：乙腈-0.1%甲酸和0.1%四氫呋喃的水溶液；電噴霧離子源(ESI),負(fù)離子檢測；源電壓3.06 kV, 毛細(xì)管電壓：80 V, 管透鏡補償電壓(RF lens)：-0.5 V, 源溫度105℃, 錐孔氣流：72 L/h。

3.3 建議標(biāo)準(zhǔn)加一條：測定過程中, 如果有陽性結(jié)果, 必須用DAD檢測器比較光譜圖或用液質(zhì)確認(rèn)。這樣可以準(zhǔn)確的判斷出結(jié)果。

[1]張瑗惠.基層食品藥品監(jiān)督管理局網(wǎng)站建設(shè)現(xiàn)狀與對策建議研究.山東大學(xué),2013.

[2]朱光輝, 王奇志, 王增壽, 等.反相高效液相色譜法測定甘露消毒丸中馬兜鈴酸Ⅰ、Ⅱ的含量.醫(yī)藥導(dǎo)報,2006(6):568-570.

[3]謝昭明, 李順祥, 劉杰, 等.細(xì)辛不同部位馬兜鈴酸A的含量測定.中成藥,2007,29(12):1808-1810.

[4]李慶杰, 劉永強, 常艷茹, 等.清腦止痛膠囊中馬兜鈴酸A限量測定.特產(chǎn)研究,2009(4):61-64.

[5]陳家煊.跳骨片中馬兜鈴酸A的HPLC限量檢查.海峽藥學(xué),2012,24(2):51-53.

[6]張萍, 冉海琳, 肖新月, 等.細(xì)辛類植物中馬兜鈴酸A的定性及定量分析.藥物分析雜志,2006,26(6):811-814.

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2015.15.196

2015-03-17]

417000 湖南省婁底市食品藥品檢驗檢測所