胡 芳，徐婷君（1.嘉興市第二醫(yī)院眼科，浙江嘉興 314000；.平湖市第一人民醫(yī)院眼科，浙江 平湖 31400）

角膜潰瘍是一種臨床上常見的發(fā)病于眼球前層薄膜處的潰瘍性病變，其發(fā)病原因較多且極其復(fù)雜，除嚴(yán)重的外傷或者感染外，也可并發(fā)于結(jié)核或面癱等[1]。臨床上最為常見的類型主要為金黃色葡萄球菌性角膜潰瘍，顧名思義，其發(fā)病原因為金黃色葡萄球菌感染，隨后機(jī)體產(chǎn)生角膜浸潤和抗體反應(yīng)；患者最為典型的癥狀為怕光、眼睛疼痛、結(jié)膜充血紅腫[2-3]。如果沒有得到及時科學(xué)的治療，嚴(yán)重者隨著潰瘍程度的加重，可嚴(yán)重?fù)p傷其眼角膜。因此，科學(xué)有效地針對金黃色葡萄球菌所致的角膜潰瘍進(jìn)行治療顯得尤為重要[4]。酮咯酸氨丁三醇（Ketorolac tromethamine）屬非甾體類抗炎藥，可溶于水，有較好的局部滲透作用；配成水溶性滴眼液可抑制眼內(nèi)組織前列腺素（PGs）的生物合成，明顯降低房水中的PGs 水平以及由PGs 引起的血-房水屏障破壞等炎癥反應(yīng)，有效控制炎癥。其主要用于解除由過敏性結(jié)膜炎所致的眼部瘙癢、不適，具有消炎止痛作用[5]。本文針對金黃色葡萄球菌性角膜潰瘍，研究酮咯酸氨丁三醇眼用凝膠劑對兔金黃色葡萄球菌性角膜潰瘍的保護(hù)作用，現(xiàn)報道如下。

1 材料

1.1 儀器

BL-5000型裂隙燈顯微鏡（上海博覽光電儀器有限公司）；保溫箱（北京福意電器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

酮咯酸氨丁三醇眼用凝膠（沈陽興齊眼科股份有限公司，批號：20120510、20120511、20130512，規(guī)格：5 ml ∶600 mg、5 ml ∶400 mg、5 ml ∶200 mg）；鹽酸氯胺酮注射液（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號：H32022820，規(guī)格：2 ml ∶0.1 g）；鹽酸異丙嗪注射液（上海禾豐制藥有限公司，批號：H31022033，規(guī)格：2 ml ∶50 mg）；克拉霉素眼用凝膠（浙江亞太藥業(yè)股份有限公司，批號：H20058223，規(guī)格：5 ml ∶200 mg）；生理鹽水（天津藥業(yè)焦作有限公司，批號：H20044024，規(guī)格：10 ml∶90 mg）。

1.3 動物

1.4 菌株

金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC 25923）購自上海士鋒生物科技有限公司。

2 方法

2.1 細(xì)菌的培養(yǎng)

在金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株上挑取單個菌落，在實驗開始的第1天將其接種于含胎牛血清的培養(yǎng)基上，隨后在保溫箱里進(jìn)行培養(yǎng)，最后向所培養(yǎng)的菌株里加入生理鹽水，制備成菌懸液[6]。整個過程要注意無菌操作，保證菌種的單一性，同時控制菌懸液的細(xì)胞密度為3.0×109ml－1左右。

2.2 復(fù)制角膜潰瘍模型

采用角膜實質(zhì)層接種法。分別將1 ml鹽酸氯胺酮注射液和1 ml鹽酸異丙嗪注射液混合后，sc給藥；待家兔達(dá)到全麻的效果后，將事先準(zhǔn)備好的0.1 ml金黃色葡萄球菌懸液從角膜中央緩慢注入實質(zhì)層，待角膜形成5.0 mm的混濁區(qū)時停止注射，即模型復(fù)制完畢。

2.3 分組與給藥

取100只家兔，分籠進(jìn)行喂養(yǎng)，嚴(yán)格遵循喂養(yǎng)原則，按時給予充足的食物和水。本次實驗之前，所有家兔經(jīng)裂隙燈顯微鏡觀察眼部情況，均顯示正常。實驗時，采用角膜實質(zhì)層接種法復(fù)制金黃色葡萄球菌性角膜潰瘍家兔模型，并按照隨機(jī)數(shù)字表法將其分成模型（生理鹽水）組、陽性對照（克拉霉素眼用凝膠）組和凝膠劑高、中、低劑量（酮咯酸氨丁三醇眼用凝膠劑120、80、40 mg/ml）組，每組20只，保證各組的潰瘍面積大小無差異。每組家兔每日給藥1次，每次1滴，連續(xù)給藥2周。每次劑量嚴(yán)格按照研究要求進(jìn)行，用藥部位為角膜潰瘍面。

2.4 觀察指標(biāo)和療效評價標(biāo)準(zhǔn)

2.4.1 角膜評分 按照改進(jìn)的McNeill 角膜病變程度分級法進(jìn)行角膜評分[7]：0 分為角膜實質(zhì)層清晰；1 分為角膜輕度水腫；2 分為角膜嚴(yán)重水腫；3 分為角膜明顯混濁；4 分為角膜嚴(yán)重水腫且前房積膿。

2.4.2 臨床療效評價 依據(jù)原衛(wèi)生部頒布的《藥物臨床研究指導(dǎo)原則》，分為顯效、有效、無效3級。其中，顯效為潰瘍面積小于1 mm；有效為潰瘍面積2～5 mm；無效為潰瘍面積大于5 mm?？傆行剩剑拷M顯效例數(shù)+有效例數(shù)）/每組總數(shù)×100%。

2.5 視網(wǎng)膜觀察

于末次給藥后，顯微鏡觀察各組家兔的視網(wǎng)膜變化。具體病理切片制作步驟：將固定好的眼球取出，以摘除眼球時標(biāo)記的打藥位置為中心矢狀切除兩旁組織，保留脈絡(luò)膜上腔注射位置兩邊各0.5 cm 寬的由角膜頂端至視神經(jīng)孔的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。將切好的組織標(biāo)本置于體積分?jǐn)?shù)為70%、80%、85%、95%的乙醇中，分別脫水50 min，再以無水乙醇脫水3 次，各1 h。用二甲苯浸泡眼球30 min，使組織透明。將加熱溶解的石蠟（石蠟熔點為60 ℃左右）浸入組織各1 h，然后立即埋于石蠟中進(jìn)行冷卻。制好的蠟塊放置于切片機(jī)上切片，切片貼附在載玻片上進(jìn)行70 ℃烘烤1 h。將載玻片浸入二甲苯10 min、無水乙醇1 min 及95%、90%、85%乙醇各1 min 進(jìn)行脫蠟，然后蒸餾水沖洗。將沖洗好的載玻片進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色，染色后使用80%、95%、95%乙醇和無水乙醇分別清洗1 min，二甲苯清洗約2 min，中性樹脂膠封固，于顯微鏡下觀察視網(wǎng)膜變化。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 治療前后角膜評分比較

與模型組比較，陽性對照組和凝膠劑各劑量組家兔給藥后角膜潰瘍病變均有改善，角膜評分減小、總有效率增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且凝膠劑高、中劑量組效果優(yōu)于陽性對照組（P＜0.05）。各組家兔給藥前后角膜評分結(jié)果見表1，療效評價結(jié)果見表2。

3.2 組織結(jié)構(gòu)

各組家兔均未發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)血管異常擴(kuò)張、視網(wǎng)膜下出血以及炎癥滲出等反應(yīng)。這表明本實驗對視網(wǎng)膜無影響。各組家兔給藥后視網(wǎng)膜切片圖見圖1。

表1 各組家兔給藥前后角膜評分結(jié)果Tab 1 Keratopathy score of rabbits in each group before and after medication

表2 各組家兔給藥前后療效評價結(jié)果[例（%）]Tab 2 Therapeutic efficacy of rabbits in each group before and after medication[case（%）]

圖1 各組家兔給藥后視網(wǎng)膜切片圖（HE，×100）A.模型組；B.陽性對照組；C.凝膠劑高劑量組；D.凝膠劑中劑量組；E.凝膠劑低劑量組Fig 1 Retinal slice of rabbits in each group after medication（HE，×100）A.model group；B.positive control group；C.gel high-dose group；D.gel medium-dose group；E.gel low-dose group

4 討論

角膜潰瘍是臨床上常見的眼部疾病，多數(shù)情況下是由細(xì)菌引起的，特別是金黃色葡萄球菌，這主要由于金黃色葡萄球菌分布較廣和致病性較強(qiáng)，常常引發(fā)各種感染[8]。目前臨床上針對金黃色葡萄球菌所致的角膜潰瘍多采用抗生素類藥物進(jìn)行治療，然而隨著藥物的長期應(yīng)用，已出現(xiàn)明顯的耐藥性，因此臨床上有必要找到新的抗生素類藥物來對抗此類疾病。同時由于角膜潰瘍危害性之大、發(fā)病率之高，找到科學(xué)有效的治療藥物迫在眉睫[9]。本次實驗中針對家兔金黃色葡萄球菌性角膜潰瘍采用兩種方法進(jìn)行治療，其中陽性對照組采用克拉霉素眼用凝膠進(jìn)行治療?？死顾厥且环N在紅霉素的基礎(chǔ)上研制而成的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，其抗菌范圍較廣，能夠應(yīng)對各種適應(yīng)證，且抗菌效果較好，已經(jīng)在臨床上得到廣泛的應(yīng)用[10]；然而，由于其水溶性較差，藥物吸收量較小，臨床治療效果并不明顯，應(yīng)用于眼科治療時具有一定局限性。另一種方法是采用酮咯酸氨丁三醇眼用凝膠劑進(jìn)行治療，其能夠在較短的時間內(nèi)緩解和消除疼痛，通過抑制PGS的合成來發(fā)揮作用，在短期即可抵抗金黃色葡萄球菌所致的感染，并對潰瘍面進(jìn)行修復(fù)，促進(jìn)潰瘍的愈合，具有較好的臨床效果[11]。在本次實驗中，對5 組家兔治療前后角膜評分和療效進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)凝膠劑各劑量組家兔治療后角膜評分明顯低于治療前，且明顯低于陽性對照組，總有效率明顯高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

綜上所述，酮咯酸氨丁三醇眼用凝膠劑對兔金黃色葡萄球菌性角膜潰瘍有較為明顯的保護(hù)作用，既可有效減輕角膜病變，又可縮小角膜潰瘍面積，顯著提高治療有效率，為該藥臨床使用提供了實驗依據(jù)。

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