李 飛，梁嘉碧，祁 真，郭新銘（中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院，廣東珠海 519000）

植入式緩控釋給藥系統(tǒng)是緩控釋制劑的一個(gè)重要組成部分，因其具有使藥物生物活性增強(qiáng)及生物利用度提高等特點(diǎn)，應(yīng)用范圍也越來(lái)越廣，例如用在腫瘤、心血管等方面的治療[1]。多柔比星（Doxorubicin，Dox）是臨床常用的抗腫瘤藥物，但因其心臟、腎臟毒性大，限制了其臨床應(yīng)用。現(xiàn)急于尋找一種更有效的制劑，以最大限度提高腫瘤組織內(nèi)Dox的濃度，最大限度降低心臟和腎臟內(nèi)Dox的濃度[2]。鑒于上述需求，本研究將Dox做成植入式緩控釋系統(tǒng)，在金屬鉭支架材料表面利用靜電自組裝反應(yīng)制備出載透明質(zhì)酸-甲基膠原-三元共聚物/Dox 復(fù)合膜的鉭支架，并采用正交設(shè)計(jì)優(yōu)化處方，為下一步該緩釋系統(tǒng)用于臨床植入治療骨腫瘤奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

紫外分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo Scientific公司）；JB-3定時(shí)恒溫磁力攪拌器（上海電磁新徑儀器公司）；LGJ-25C冷凍干燥機(jī)（長(zhǎng)沙湘儀儀器公司）；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器公司）；NOVA 系列NANNOSEM600 共聚焦掃描電鏡（德國(guó)FEI 公司）；SHC-C 水浴恒溫振蕩器（江蘇環(huán)宇儀器公司）。

1.2 藥品與試劑

Dox 原料藥（深圳萬(wàn)樂(lè)藥業(yè)公司，批號(hào)：1203A3，純度：＞98%）；Ⅰ型膠原（華南理工大學(xué)材料學(xué)院提供）；透明質(zhì)酸（美國(guó)Lifecore 生物公司）；多孔金屬鉭支架材料（美國(guó)Zimmer 公司）；甲基丙烯酸羥乙酯、甲基丙烯酸甲酯和甲基丙烯酸單體（廣州永屹化工有限公司，批號(hào)：1104B8、1204A4、1009A1，純度：均＞98%）。

1.3 其他

透析袋（北京鼎國(guó)科技公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 成膜材料的制備

2.1.1 甲基膠原的制備 稱取適量Ⅰ型膠原加入到20 ml 的0.1 mol/L的鹽酸溶液中，溶解制成透明膠原溶液，將膠原溶液加入到400 ml 丙酮中，攪拌，產(chǎn)生沉淀。靜置一段時(shí)間，將產(chǎn)生的沉淀膠原置于200 ml 含0.1 mol/L 鹽酸的甲醇溶液中，在4 ℃無(wú)菌條件下攪拌。然后將甲基化后的200 ml 混合溶液裝入透析袋中，置于盛有蒸餾水的燒杯中，透析直到蒸餾水的pH為6.3。整個(gè)過(guò)程溫度保持在4 ℃。移除透析袋里的溶液，對(duì)甲基膠原溶液冷凍干燥。

2.1.2 三元共聚物的制備 在78 ℃、雙偶氮異丁腈的啟動(dòng)下，加入0.1 mol/L 甲基丙烯酸羥乙酯、甲基丙烯酸甲酯和甲基丙烯酸單體在異丙醇中，減壓蒸餾，各單體的摩爾比為25 ∶25 ∶50，單體與溶劑比例為1 ∶6（m/V）。在油浴中磁性攪拌，合成甲基丙烯酸羥乙酯-甲基丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸的三元共聚物。反應(yīng)24 h后降至室溫，加入過(guò)量的石油醚，聚合物即沉淀析出。過(guò)濾沉淀，加入少量乙醇溶解，置于蒸餾水中再次沉淀，回收沉淀物，即得三元共聚物。

2.2 載透明質(zhì)酸-甲基膠原-三元共聚物/Dox復(fù)合膜的鉭支架的制備

將金屬鉭支架材料放入透明質(zhì)酸溶液中，放入真空干燥器中負(fù)壓抽吸。將吸附有透明質(zhì)酸的鉭支架材料進(jìn)行冷凍干燥。取適量甲基膠原溶液和Dox溶液，混合均勻，然后用加樣槍定量吸取混合溶液滴加在鉭材料上，真空干燥；再用加樣槍吸取適量三元共聚物溶液滴加在鉭材料上，充分反應(yīng)1 h后真空干燥，制得載透明質(zhì)酸-甲基膠原-三元共聚物/Dox復(fù)合膜的鉭支架。用共聚焦掃描電鏡觀察所制備復(fù)合膜的鉭支架材料內(nèi)部，以空白鉭支架材料內(nèi)部為對(duì)照，可觀察到所制復(fù)合膜內(nèi)部有明顯的膜（圖1黑框處）形成，證明了透明質(zhì)酸、甲基膠原、三元共聚物通過(guò)靜電自組裝反應(yīng)形成了均勻分布的復(fù)合膜[3]。共聚焦掃描電鏡圖見(jiàn)圖1。

圖1 共聚焦掃描電鏡圖Fig 1 Confocal scanning electron microgram

2.3 Dox含量測(cè)定方法考察[4]

精密稱取Dox原料藥，加pH 7.2磷酸鹽緩沖液（PBS）溶解并定量稀釋制成0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10 μg/ml 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，以pH 7.2 PBS為空白，采用紫外分光光度法測(cè)定234 nm波長(zhǎng)處的吸光度。以吸光度（y）為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)進(jìn)行回歸分析，得回歸方程為y＝0.001 2x+0.022 5（r＝0.999 8）；日內(nèi)RSD小于1.83%（n＝5），日間RSD小于2.01%（n＝5）。

2.4 體外釋放度方法考察[5]

將制備的載復(fù)合膜的鉭支架材料置于裝有2 ml PBS的深色離心管中，于37 ℃下水浴搖床中振搖（80 r/min），考察30 d內(nèi)的體外累積釋放度。樣品溶液經(jīng)濾過(guò)后用pH 7.2的PBS稀釋，搖勻，作為供試品溶液，按照“2.3”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度，并代入回歸方程計(jì)算含量，再計(jì)算累積釋放度。

2.5 正交設(shè)計(jì)優(yōu)化處方工藝及驗(yàn)證

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，以對(duì)影響累積釋放度的3 個(gè)主要因素：透明質(zhì)酸（A）、甲基膠原（B）、三元共聚物的質(zhì)量濃度（C）。以A、B、C為因素，以1、30 d的累積釋放度為指標(biāo)，按正交表設(shè)計(jì)試驗(yàn)，優(yōu)化處方[6]。因素與水平見(jiàn)表1，正交試驗(yàn)結(jié)果與極差分析見(jiàn)表2，方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

由表2可知，根據(jù)1 d累積釋放度結(jié)果顯示，因素對(duì)處方的影響程度為A＞B＞C；根據(jù)30 d累積釋放度結(jié)果顯示，因素對(duì)處方的影響程度為B＞A＞C。由表3可知，就1 d累積釋放度而言，A對(duì)處方有顯著影響（P＜0.05），其余因素對(duì)處方無(wú)顯著影響。綜合考慮，最優(yōu)處方為A1B3C3，即透明質(zhì)酸1 mg/ml、甲基膠原4.5 mg/ml、三元共聚物100 mg/ml。

表1 因素與水平（mg/ml）Tab 1 Factors and levels（mg/ml）

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果與極差分析Tab 2 Result of orthogonal experiments and range analysis

表3 方差分析結(jié)果Tab 3 Analysis of variance

按最優(yōu)處方制備3 批樣品，按“2.4”項(xiàng)下方法考察1、30 d的累積釋放度，結(jié)果分別為（7.57±2.3）%、（84.14±2.1）%。

2.6 釋放機(jī)制分析

在“2.5”項(xiàng)下驗(yàn)證試驗(yàn)過(guò)程中，分別于1、2、3、5、10、14、18、22、26、30 d取樣，測(cè)定并計(jì)算累積釋放度。以累積釋放度對(duì)時(shí)間作圖，繪制體外釋放曲線，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 復(fù)合膜中Dox的體外釋藥曲線Fig 2 Release curve of Dox in compound membranes in vitro

由圖2可知，Dox在初始時(shí)快速釋放，有釋藥沖擊量；隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，每日釋放量減少；且在20 d 后，體系的每日釋放量隨著時(shí)間的增長(zhǎng)而緩慢減小，溶出速率趨于穩(wěn)定，近似為零級(jí)速率釋藥。由此可見(jiàn)，該緩釋系統(tǒng)在體外模擬環(huán)境下可維持緩釋時(shí)間達(dá)30 d。

3 討論

本試驗(yàn)中所采用的植入材料為多孔金屬鉭支架材料，其生物相容性好、彈性模量接近松質(zhì)骨，具有非降解特性，物理化學(xué)性能穩(wěn)定。這種材料是通過(guò)化學(xué)蒸汽沉積法在均勻的網(wǎng)狀碳骨架表面噴涂了一層惰性金屬鉭制作而成的，其平均孔徑為430μm，孔隙率為75%～80%，孔隙間相互連通，是一個(gè)比較新穎的金屬材料。

由驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，所制Dox 植入式緩控釋系統(tǒng)30 d平均累積釋放度為84.14%，低于緩控釋制劑要求的藥物完全累積釋放度90%。究其原因，筆者認(rèn)為是多孔金屬鉭支架材料的自身問(wèn)題。

在本試驗(yàn)中，影響制備Dox 植入式緩控釋系統(tǒng)的因素除了成膜材料的濃度外，筆者認(rèn)為還包括自組裝反應(yīng)的時(shí)間與溫度。本次研究中統(tǒng)一反應(yīng)時(shí)間為1 h、反應(yīng)溫度為室溫，后續(xù)試驗(yàn)中筆者將對(duì)其作進(jìn)一步優(yōu)化。

本試驗(yàn)研制的Dox植入式緩控釋系統(tǒng)體外釋放符合擬訂的釋藥速度要求。由正交設(shè)計(jì)可見(jiàn)，透明質(zhì)酸作為大分子黏彈性物質(zhì)[7]，其對(duì)釋藥速度影響最大。由釋放度結(jié)果可見(jiàn)，制備的Dox緩控釋系統(tǒng)具有緩釋作用，釋放度重現(xiàn)性良好，但該系統(tǒng)在動(dòng)物體內(nèi)釋放、吸收等情況還有待進(jìn)一步研究。

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