郭錫春，高 華，劉 坤，劉占濤，張 婕，高 文，劉春寶，吳巖強(qiáng)（1.濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥劑科，山東濰坊 6101；.青島大學(xué)藥學(xué)院，山東青島 6601；.青島大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，山東青島 6601；.大連棒棰島海產(chǎn)股份有限公司，遼寧大連 116100）

近年來，有關(guān)自由基在各種疾病發(fā)病機(jī)制中的作用日益受到重視。研究表明，自由基損傷機(jī)制與環(huán)磷酰胺（Cyclophosphamide，CP）引起的生精功能障礙有密切關(guān)系[1]。含氧自由基及其產(chǎn)物會(huì)利用機(jī)體的脂質(zhì)過氧化作用影響細(xì)胞的正常生理功能，甚至引起細(xì)胞死亡[2]。

海參作為人們熟知的海中珍品，具有較高的營養(yǎng)價(jià)值，其含有的多種活性成分已被證實(shí)具有抗腫瘤、抗凝血、抗氧化、提高免疫力及延緩衰老的藥理作用[3-4]。海參精囊為海參的生殖器官，也具有較高的營養(yǎng)價(jià)值。因此本實(shí)驗(yàn)通過建立衰老的動(dòng)物模型，利用不同劑量的海參精囊提取物飼養(yǎng)小鼠，檢測提取物對小鼠睪丸的總超氧化物歧化酶（T-SOD）活性、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）活性和丙二醛（MDA）水平的影響，同時(shí)觀察睪丸和附睪的臟器指數(shù)變化，以探討海參精囊提取物對CP誘導(dǎo)的小鼠睪丸氧化損傷的保護(hù)作用。

1 材料

1.1 儀器

AR5120 型電子天平（奧豪斯國際貿(mào)易上海有限公司）；DK-98-1 型電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）；SK3200H 型超聲波清洗機(jī)（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；冷凍干燥機(jī)（北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；LD4-2A型低速離心機(jī)（北京雷勃爾離心機(jī)有限公司，離心半徑：5 cm）；723N 型可見分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 藥材

海參精囊由大連棒棰島海產(chǎn)股份有限公司提供，所用海參為刺參（Stichopus japonicus），由中國科學(xué)院海洋研究所段德麟研究員鑒定。

1.3 藥品與試劑

0.9%氯化鈉（NaCl）溶液（辰欣藥業(yè)股份有限公司，批號：1207215121）；甲睪酮片（上海信誼康捷藥業(yè)有限公司，批號：110802，規(guī)格：5 mg/片）；注射用CP（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號：12031425，規(guī)格：0.2 g/瓶）；總蛋白定量測試盒、TSOD 測試盒、GSH-PX 測試盒、MDA 測試盒（南京建成生物工程研究所，批號：20130604、20130603、20130525、20130605）。

1.4 動(dòng)物

2 方法

2.1 提取物的制備

2.1.1 海參精囊水提物 稱取一定量海參精囊，用組織勻漿器打碎，按質(zhì)量比1∶3加入蒸餾水，采用超聲波輔助提取，超聲溫度30 ℃，超聲時(shí)間25 min，然后水浴30 ℃條件下攪拌提取2 h，并以4 000 r/min 離心5 min，取上清液；沉淀物按質(zhì)量比1 ∶2加入蒸餾水，重復(fù)上述操作，合并上清液，通過快速定性濾紙濾過，濾液旋蒸濃縮至1/3時(shí)，進(jìn)行冷凍干燥得到粗提物。

2.1.2 海參精囊醇提物 將預(yù)凍好的海參精囊進(jìn)行冷凍干燥，然后稱取一定量，粉碎，按質(zhì)量比1 ∶10 加入無水乙醇，30 ℃條件下攪拌提取3 h，濾過后取濾液；殘?jiān)促|(zhì)量比1∶5加入無水乙醇，重復(fù)上述操作，合并濾液，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮并回收乙醇，濃縮液進(jìn)行真空干燥得到浸膏。

2.2 動(dòng)物模型制備及分組、給藥

108 只小鼠隨機(jī)分成9 組，每組12 只，空白組腹腔注射0.9%氯化鈉溶液，其他各組均腹腔注射CP（28 mg/kg），連續(xù)5 d 以復(fù)制動(dòng)物雄激素部分缺乏、生殖系統(tǒng)受損模型；同時(shí)灌胃給予相應(yīng)的藥物：海參精囊水提物和醇提物各組分別給予海參精囊水提物[150、300、600 mg（生藥）/kg]、海參精囊醇提物[150、300、600 mg（生藥）/kg]，陽性對照組灌胃甲睪酮溶液（1.5 mg/kg），空白組和模型組灌胃同體積的蒸餾水，連續(xù)4周。

2.3 指標(biāo)的測定

在小鼠飼養(yǎng)過程中，每組會(huì)有1～2 只死亡。為方便進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)描述，故統(tǒng)一測定10只小鼠的指標(biāo)。末次給藥24 h后，頸椎脫臼處死小鼠，立即去雙側(cè)睪丸和附睪稱質(zhì)量，觀察睪丸、附睪臟器指數(shù)的變化（睪丸、附睪與體質(zhì)量的比值）。另取右側(cè)睪丸組織，按質(zhì)量（g）∶體積（ml）＝1 ∶9的比例加入9倍體積的0.9%氯化鈉溶液，冰水浴條件下勻漿，制備成10%的勻漿液，2 500～3 000 r/min離心10 min，取上清液嚴(yán)格按照試劑盒說明書方法檢測。睪丸組織總蛋白含量用考馬斯亮藍(lán)法測定，T-SOD 活性采用羥胺法測定，GSH-PX 活性采用比色法測定，MDA含量采用硫代巴比妥酸法測定。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 海參精囊提取物對小鼠臟器指數(shù)的影響

與空白組比較，模型組小鼠的睪丸及附睪的臟器指數(shù)明顯減小，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01或P＜0.05）；與模型組比較，給藥各組小鼠的臟器指數(shù)均明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01或P＜0.05）；其中，附睪質(zhì)量和附睪指數(shù)呈現(xiàn)出量效關(guān)系，結(jié)果見表1。

表1 海參精囊提取物對小鼠臟器指數(shù)的影響（，n＝10）Tab 1 Effects of holothurian spermatophore extracts on viscera indexes of mice（，n＝10）

表1 海參精囊提取物對小鼠臟器指數(shù)的影響（，n＝10）Tab 1 Effects of holothurian spermatophore extracts on viscera indexes of mice（，n＝10）

注：與空白組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01Note：vs.blank group，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.model group，#P＜0.05，##P＜0.01

3.2 相關(guān)氧化指標(biāo)的檢測

3.2.1 睪丸組織蛋白濃度的檢測結(jié)果 模型組小鼠經(jīng)CP 處理后，睪丸組織中蛋白濃度明顯降低，與空白組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組比較，給藥各組小鼠的睪丸組織蛋白濃度均升高（P＜0.01或P＜0.05），結(jié)果見表2。

3.2.2 T-SOD的檢測結(jié)果 連續(xù)應(yīng)用5 d CP，導(dǎo)致小鼠睪丸組織中T-SOD 含量顯著降低；而海參精囊兩種提取物均逆轉(zhuǎn)了T-SOD的下降，使組織內(nèi)T-SOD含量顯著回升，均接近或超過空白組水平，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01或P＜0.05），結(jié)果見表2。

表2 海參精囊提取物對小鼠睪丸組織抗氧化能力的影響（，n＝10）Tab 2 Effects of holothurian spermatophore extracts on anti-oxidative capacity of testis（，n＝10）

表2 海參精囊提取物對小鼠睪丸組織抗氧化能力的影響（，n＝10）Tab 2 Effects of holothurian spermatophore extracts on anti-oxidative capacity of testis（，n＝10）

注：與空白組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01Note：vs.blank group，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.model group，#P＜0.05，##P＜0.01

3.2.3 GSH-PX 的檢測結(jié)果 經(jīng)檢測，連續(xù)5 d 注射CP，使睪丸組織中GSH-PX顯著下降，模型組與空白組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；海參精囊兩種提取物的使用顯著提高了組織中GSH-PX 的水平，與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01或P＜0.05），結(jié)果見表2。

3.2.4 MDA的檢測結(jié)果 CP處理后，模型組小鼠睪丸組織中MDA含量顯著上升，其變化趨勢與T-SOD和GSH-PX相反，與空白組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。海參精囊兩種提取物均顯著降低睪丸組織中MDA含量，與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01或P＜0.05），結(jié)果見表2。

4 討論

“自由基”學(xué)說是國內(nèi)外研究的衰老理論的一種，最早是由Denham Harman 于1955 年提出的：氧自由基在機(jī)體的氧化代謝過程中不斷產(chǎn)生，然后與核酸蛋白質(zhì)和脂肪等物質(zhì)反應(yīng)，生成相應(yīng)的氧化物和過氧化物[5-6]。在正常生理?xiàng)l件下，機(jī)體的氧化和抗氧化系統(tǒng)維持在動(dòng)態(tài)平衡條件下，生物體內(nèi)的自由基不斷產(chǎn)生，也不斷被抗氧化系統(tǒng)清除[7]。機(jī)體的抗氧化系統(tǒng)主要包括酶促和非酶促兩個(gè)體系，其中酶促防御系統(tǒng)是通過體內(nèi)的各種抗氧化酶來抑制不同自由基和活性氧的產(chǎn)生，包括SOD、GSH-PX和過氧化氫酶（CAT）。SOD是歧化超氧陰離子（O2－）的專一性酶，由于O2－是活性氧生成過程中的初始產(chǎn)物，并對GSH-PX、CAT 將H2O2轉(zhuǎn)化為H2O 的反應(yīng)具有催化作用，因此，SOD 被稱作活性氧防御的第一線。GSH-PX 和CAT 主要起到后背支持的作用，其活性高低均反映出機(jī)體內(nèi)抗氧化水平。另外，MDA是氧自由基引起的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)產(chǎn)生的主要最終代謝產(chǎn)物，可以用來作為衡量氧化應(yīng)激程度的指標(biāo)[8-9]。

隨著年齡增加，機(jī)體清除自由基的能力降低，打破了氧化抗氧化系統(tǒng)的平衡，主要表現(xiàn)為氧化作用增強(qiáng)、抗氧化能力減弱、自由基過量而產(chǎn)生過氧化脂肪，從而引起機(jī)體的損傷[10]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠睪丸組織T-SOD、GSH-PX 活性和睪丸、附睪指數(shù)顯著降低，MDA水平顯著升高，提示CP可以導(dǎo)致睪丸組織細(xì)胞中氧自由基生成增多。T-SOD 和GSH-PX 被大量消耗，不能使過量生成的自由基得以清除，從而加重了脂質(zhì)過氧化程度，使氧化和抗氧化系統(tǒng)失衡、生殖細(xì)胞損傷及代謝障礙，進(jìn)而損傷生殖系統(tǒng)，使小鼠的睪丸和附睪萎縮。與模型組比較，給藥各組小鼠睪丸組織T-SOD、GSH-PX活性和睪丸、附睪指數(shù)顯著增高，MDA 水平明顯降低，說明海參精囊提取物能很好地降低睪丸組織MDA 水平，防止氧自由基損傷，提高睪丸組織T-SOD 活性和GSH-PX 活性，提高組織細(xì)胞抗氧化和清除自由基的能力，從而維持細(xì)胞內(nèi)氧化抗氧化系統(tǒng)的平衡，減輕機(jī)體受自由基損傷的程度，對抗衰老小鼠睪丸和附睪的萎縮。

本研究發(fā)現(xiàn)，CP可以使睪丸組織脂質(zhì)過氧化水平上升、超氧化反應(yīng)加強(qiáng)，這可能是造成睪丸損害的途徑之一，但也無法排除與非酶促防御系統(tǒng)存在失衡有關(guān)。海參精囊兩種提取物對CP誘導(dǎo)的小鼠睪丸氧化損傷有保護(hù)作用。

[1]靳鐳，陳守真.冬蟲夏草對抗環(huán)磷酰胺致小鼠睪丸氧化損傷的作用[J].中國婦幼保健，2008，23（13）：1 858.

[2]寇素茹，謝雪蘭，段斐，等.鋅對小鼠睪丸組織NO的含量及抗氧化作用的影響[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2008，35（19）：3 855.

[3]黃日明，王賓，劉永宏，等.海參的化學(xué)成分及其生物活性的研究概況[J].中成藥，2009，31（8）：1 263.

[4]周靖宇.海參用于保健食品功能原料的藥理研究進(jìn)展[J].齊魯藥事，2011，30（6）：346.

[5]陳霞.衰老機(jī)制的中西醫(yī)研究進(jìn)展及延緩衰老的途徑[D].南京：南京中醫(yī)藥大學(xué)，2011.

[6]張娜，張耀恒，張軼，等.精液處理前后精子的DNA損傷與活性氧之間的關(guān)系研究[J].中國男科學(xué)雜志，2012，26（6）：7.

[7]江少波，孫潔，蔣遠(yuǎn)春，等.補(bǔ)腎填精方對電磁輻射所致小鼠睪丸組織SOD 活性和MDA 含量的研究[J].中國中西醫(yī)結(jié)合外科雜志，2010，16（5）：554.

[8]Serra JA，Marschoff ER，Dominguez RO，et al.Comparison of the determination of superoxide dismutase and antioxidant capacity in neurological patients using two different procedures[J].Clin Chim Acta，2000，301（1/2）：87.

[9]蔡威黔，繆建春，駱佑娣，等.丹參、川芎嗪復(fù)方制劑對老年性癡呆模型大鼠紅細(xì)胞及腦組織SOD、MDA 的影響研究[J].中國藥房，2008，19（21）：1 608.

[10]朱玉昌.橙汁抗氧化活性成分及總抗氧化能力的研究[D].重慶：西南大學(xué)，2006.