陳　蕓， 周　鵬， 張子平， 謝芳靖， 蔡明夷，王藝?yán)?/p>

(集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，福建 廈門(mén) 361021)

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大黃魚(yú)cyp19a/b基因的克隆與表達(dá)分析

陳蕓， 周鵬， 張子平， 謝芳靖， 蔡明夷，王藝?yán)?/p>

(集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，福建 廈門(mén) 361021)

[摘要]克隆得到了調(diào)節(jié)雌雄激素平衡的大黃魚(yú)cyp19a/b基因,cyp19a基因cDNA全長(zhǎng)1805 bp(NCBI登錄號(hào)：FJ800566)，其中開(kāi)放閱讀框1557 bp，編碼518個(gè)氨基酸；cyp19b基因cDNA全長(zhǎng)2268 bp(NCBI登錄號(hào):FJ800567)，其中開(kāi)放閱讀框1503 bp，編碼500個(gè)氨基酸.熒光定量PCR分析顯示cyp19a基因在性腺中有明顯的表達(dá)，且在卵巢中的表達(dá)量極顯著且高于精巢；在肌肉、腦、肝臟、腎臟、脾臟等組織器官中基本不表達(dá).而cyp19b基因在腦、脾臟和肝臟中有較高表達(dá)，在性腺和其他器官中基本不表達(dá).

[關(guān)鍵詞]cyp19a/b基因；芳香化酶；性腺；表達(dá)差異

0引言

大黃魚(yú)(Larimichthys crocea)是我國(guó)重要的海水養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)之一，在福建省的養(yǎng)殖規(guī)模和產(chǎn)量巨大.但是目前大黃魚(yú)每年的產(chǎn)量和質(zhì)量不穩(wěn)定，主要是因?yàn)槠淇共×^差、性成熟偏早等問(wèn)題困擾養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)，極大影響了種魚(yú)的種質(zhì)和成魚(yú)的質(zhì)量.有研究表明，大黃魚(yú)體長(zhǎng)生長(zhǎng)速度隨年齡增大而遞減并逐漸趨于零，性成熟過(guò)程中的體長(zhǎng)生長(zhǎng)速度顯著降低[1].而在人工養(yǎng)殖大黃魚(yú)中，大黃魚(yú)體重增長(zhǎng)速度以2齡魚(yú)生長(zhǎng)最快，1齡魚(yú)一般50~100 g，2齡則可達(dá)300~500 g.因此人工養(yǎng)殖大黃魚(yú)以養(yǎng)殖1~2年為最佳養(yǎng)殖期[2].而目前人工養(yǎng)殖大黃魚(yú)的性成熟年齡也在1~2齡間，生長(zhǎng)期與大黃魚(yú)性成熟期的重疊在一定程度上可能會(huì)影響大黃魚(yú)的體重增長(zhǎng).因此，研究大黃魚(yú)性腺發(fā)育及性成熟的分子機(jī)制，有助于在生產(chǎn)實(shí)踐中篩選出具有優(yōu)良性狀的大黃魚(yú).

芳香化酶P450在脊椎動(dòng)物的性激素形成中有重要作用.雄激素和雌激素在體內(nèi)相關(guān)酶的作用下可相互轉(zhuǎn)化，兩者的平衡直接影響動(dòng)物性腺的正常發(fā)育.由cyp19基因編碼的芳香化酶p450是雄激素轉(zhuǎn)化生成雌激素的主要限速酶，是維持上述平衡的關(guān)鍵因子[3].在大部分硬骨魚(yú)類(lèi)中存在兩種芳香化酶，一種是由cyp19a基因編碼的性腺型芳香化酶，該基因主要在卵子的類(lèi)固醇生成鞘和顆粒細(xì)胞層表達(dá)；另一種是由cyp19b基因編碼的腦型芳香化酶，該基因主要在腦中表達(dá)[3].這兩種酶都可以使雄激素睪酮轉(zhuǎn)化成雌激素17b-雌二醇，內(nèi)源性導(dǎo)致性別逆轉(zhuǎn)[3]，因此推測(cè)cyp19基因與魚(yú)類(lèi)的性別分化有關(guān)[3].研究發(fā)現(xiàn)，在黃顙魚(yú)中cyp19a基因主要在卵巢中表達(dá)[4]；在日本比目魚(yú)中的研究表明芳香化酶的低水平表達(dá)是精巢發(fā)育所必需的[5-6].用芳香化酶抑制劑可誘導(dǎo)魚(yú)類(lèi)發(fā)生性逆轉(zhuǎn)，主要是因?yàn)樵撘种苿┮种屏薱yp19基因的表達(dá)，破壞了雄激素向雌激素的轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致雌激素量減少[5-6].目前，相關(guān)研究在大黃魚(yú)中還未見(jiàn)報(bào)道.

本研究擬克隆大黃魚(yú)的cyp19a/b基因，并分析它們?cè)诖簏S魚(yú)不同組織中的表達(dá)，研究它們?cè)诖簏S魚(yú)性腺發(fā)育及成熟中可能具有的功能奠定基礎(chǔ).

1材料與方法

1.1　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)大黃魚(yú)體重500 g左右.取精巢、卵巢、肌肉、端腦、中腦、延腦、下丘腦、肝臟、腎臟、脾臟、前腎等組織，提取總RNA備用.

1.2　總RNA的抽提及基因全長(zhǎng)的獲取

各組織總RNA的提取根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室改良的RDP方法[7-8].根據(jù)已知的cyp19a/b 基因的核苷酸序列，設(shè)計(jì)正反向引物，擴(kuò)增獲得cDNA片段，并克隆測(cè)序.然后根據(jù)獲得的基因片段設(shè)計(jì)3′和5′RACE所需特異引物GSP1和GSP2，用SMART-RACE法擴(kuò)增獲得3′和5′端片段.所有獲得的cDNA片段均與pMD18-T質(zhì)粒連接后轉(zhuǎn)化成大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，并篩選陽(yáng)性克隆測(cè)序.所有自行設(shè)計(jì)的引物(見(jiàn)表1)合成及序列測(cè)序均由上海捷瑞生物工程有限公司完成.

1.3　目的基因的生物信息學(xué)分析

本文中核苷酸、氨基酸序列的同源性比對(duì)在http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi上進(jìn)行；蛋白質(zhì)分子量和等電點(diǎn)預(yù)測(cè)采用pl/Mw tool；信號(hào)肽查找在http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/進(jìn)行；跨膜區(qū)查找采用TMHMM-2.0；磷酸化位點(diǎn)查找采用NetPhos2.0 Server；糖基化位點(diǎn)查找采用NetNGlyc 1.0 Serve；氨基酸結(jié)構(gòu)域分析采用InterProScan；系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建采用MEGA4.

1.4　熒光定量PCR分析目的基因在各器官的表達(dá)

根據(jù)拼接的cyp19a/b的全長(zhǎng)cDNA序列，設(shè)計(jì)cyp19a、cyp19b、β-actin基因的熒光定量PCR引物(見(jiàn)表1).以cDNA第一條鏈為模板，β-actin為內(nèi)標(biāo)基因，各基因特異性引物和SYBR Green進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增.每個(gè)反應(yīng)的體系如下：10 μL SYBR Green Real time PCR Master Mix，0.5 μL正向、反向基因特異引物，1 μL cDNA第一條鏈及8 μL無(wú)RNase水.反應(yīng)條件為：95 ℃變性10 min后，進(jìn)行如下40個(gè)循環(huán)：95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min.雌雄大黃魚(yú)的每種器官各4個(gè)樣品，每個(gè)樣品進(jìn)行3次重復(fù).用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)樣本進(jìn)行one way ANOVA方差分析，以P<0.05為顯著水平，P<0.01為極顯著水平.

表1　實(shí)驗(yàn)中所用的引物

2結(jié)果與分析

2.1　cyp19a基因序列特征

cyp19a基因cDNA序列全長(zhǎng)1805 bp(見(jiàn)圖1，NCBI登錄號(hào)：FJ800566)，其中3′UTR(去除polyA部分)長(zhǎng)229 bp，開(kāi)放閱讀框(Open reading frame，ORF)長(zhǎng)1557 bp.cyp19a cDNA可編碼518個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)其分子質(zhì)量約為58.7 ku，等電點(diǎn)約為6.68.該序列在T59-D60有一個(gè)信號(hào)肽酶切位點(diǎn)，在V32-A55和S67-A90位置分別具有一個(gè)由23個(gè)氨基酸組成的跨膜區(qū).磷酸化位點(diǎn)(Phosphorylation sites)分析顯示有9個(gè)絲氨酸(Ser)磷酸化位點(diǎn)，3個(gè)蘇氨酸(Thr)磷酸化位點(diǎn)和3個(gè)酪氨酸(Tyr)磷酸化位點(diǎn)；糖基化位點(diǎn)(N-x-S/T)在N145區(qū)域.進(jìn)一步用InterProScan分析發(fā)現(xiàn)cyp19a有一個(gè)半胱氨酸鐵-血紅素配體特征區(qū)序列，即[FW]-[SGNH]-x--{F}-[RKHPT]-{P}-C-[LIVMFAP]-[GAD] (此序列位于442-451氨基酸之間，為FGSGPRSCVG)，該區(qū)是對(duì)芳香化酶活性起關(guān)鍵作用的保守區(qū)Ⅲ(血紅素結(jié)合區(qū)).此外，對(duì)芳香化酶活性起關(guān)鍵作用的保守區(qū)Ⅰ(Ⅰ-螺旋區(qū))、Ⅱ(P450arom特異保守區(qū))也被發(fā)現(xiàn).

2.2　cyp19b基因序列特征

cyp19b基因cDNA序列全長(zhǎng)2268bp(NCBI:FJ800567) (見(jiàn)圖2).其中3′UTR(去除polyA部分)長(zhǎng)748bp；ORF長(zhǎng)1503bp.

cyp19bcDNA編碼500個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)其分子質(zhì)量約為56.7ku，等電點(diǎn)約為7.12.該序列在S36-R37有一個(gè)信號(hào)肽酶切位點(diǎn).在Q10-F32和G45-G67區(qū)域分別有一個(gè)由22個(gè)氨基酸組成的跨膜區(qū).磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)顯示有7個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn)，4個(gè)蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)和3個(gè)酪氨磷酸化位點(diǎn)；糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)顯示有兩個(gè)位點(diǎn)分別是在N9和N39.與cyp19a類(lèi)似，與芳香化酶活性有關(guān)的保守區(qū)I、II、III(位于426-435氨基酸之間，為FGCGPCSCVG)均被發(fā)現(xiàn).

2.3　cyp19a同源性分析

本文選作同源性比對(duì)的GenBank上已注冊(cè)的cyp19a氨基酸序列有：

大黃魚(yú)(Larimichthyscrocea)ACO35041.1、真鯛(Pagrusmajor)BAB82524.1

點(diǎn)帶石斑魚(yú)(Epinepheluscoioides)AAR97601.1、平鯛(Rhabdosargussarba)ABC70869.1

金頭鯛(Sparusaurata)AAL27699.1、細(xì)須石首魚(yú)(Micropogoniasundulatus)ABA26927.1

日本擬隆頭魚(yú)(Pseudolabrusjaponicus)ABB96485.1、鯔魚(yú)(Mugilcephalus)AAW72732.1

花溪鳉(Kryptolebiasmarmoratus)ABC68614.1、鱈魚(yú)(Gadusmorhua)ADM15036.1

青鳉(Oryziaslatipes)Q92087.1、綠鰭?cǎi)R面鲀(Thamnaconusseptentrionalis)AFM35729.1

虹鱒(Oncorhynchusmykiss)1806325A、細(xì)棘海豬魚(yú)(Halichoerestenuispinis)AAR37048.1

泥鰍(Misgurnusanguillicaudatus)BAJ19136.1、金魚(yú)(Carassiusauratus)AAC14013.1

鯉魚(yú)(Cyprinuscarpio)ACB13197.1、斑馬魚(yú)(Daniorerio)AAK00643.1

雞(Gallusgallus)NP_001001761.1、大鼠(Rattusnorvegicus)NP_058781.2

人(Homosapiens)P11511.3.

結(jié)果表明，大黃魚(yú)cyp19a的氨基酸序列與其他魚(yú)類(lèi)的氨基酸序列同源性較高.其與細(xì)須石首魚(yú)的同源性為96%；與點(diǎn)帶石斑魚(yú)的同源性為95%；與真鯛、斑馬魚(yú)、金魚(yú)的同源性分別是94%、80%和80%；與非洲爪蟾和人類(lèi)的同源性分別是74%和49%.

2.4　cyp19b基因同源性分析

同源性比對(duì)選用GenBank上已注冊(cè)的cyp19b的氨基酸序列有：

大黃魚(yú)ACO35042.1、平鯛ABC70868.1、日本擬隆頭魚(yú)ABB96486.1、鯉魚(yú)ACB13198.1

細(xì)棘海豬魚(yú)AAR37047.1、大西洋庸鰈(Hippoglossushippoglossus)Q4VC53

三星攀鱸(Trichogastertrichopterus)ABR66863.1、鯔魚(yú)AAW72730.1、金魚(yú)AAB39408.1

底鳉(Fundulusheteroclitus)AAS76199.1、花溪鳉ABC68613.1、斑馬魚(yú)AAV41033.1

虹鱒魚(yú)cyp19b-ICAC84574.1、虹鱒魚(yú)cyp19b-IICAC84575.1、南方鲇AAP83132.1

雞AAA48738.1、家鼠(Mus musculus)BAA00551.1、人 :P11511.3.

結(jié)果表明，大黃魚(yú)cyp19b氨基酸序列與平鯛同源性最高，為86%；與大西洋鳙鰈、鯔魚(yú)、斑馬魚(yú)、金魚(yú)的同源性分別是85%、81%、65%和65%；與家鼠、人的同源性分別只有51%、17%.

2.5　cyp19a/b基因在大黃魚(yú)各器官中的表達(dá)

大黃魚(yú)cyp19a/b基因在各器官的表達(dá)情況見(jiàn)圖3、圖4.

經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，cyp19a在卵巢中表達(dá)量最高，顯著高于精巢.該基因在雌雄肝臟、肌肉、端腦，以及雌性脾臟中表達(dá)量比較低，而在其他各器官基本不表達(dá).大黃魚(yú)cyp19b在中腦、端腦、下丘腦、脾臟和肝臟中有較高表達(dá)量，在性腺和其他器官中基本不表達(dá).

2.6　cyp19a/b基因系統(tǒng)發(fā)育分析

采用MEGA4.0軟件，以鄰位相連法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(見(jiàn)圖5).

3討論

在哺乳動(dòng)物中只有一種芳香化酶，該酶通過(guò)中樞神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)作用，影響動(dòng)物的神經(jīng)內(nèi)分泌、繁殖及性行為[9-10]，并參與調(diào)控哺乳動(dòng)物性腺的分化[11].在硬骨魚(yú)類(lèi)中，目前發(fā)現(xiàn)金魚(yú)由一個(gè)cyp19基因編碼腦芳香化酶；而斑馬魚(yú)由兩個(gè)基因cyp19(cyp19a/b)編碼芳香化酶[12]；虹鱒中則發(fā)現(xiàn)有兩種類(lèi)型的P450aromB，可能由一個(gè)或兩個(gè)cyp19基因編碼[13].部分魚(yú)類(lèi)中cyp19a基因在卵子發(fā)生期間的卵黃卵泡中有表達(dá)，這與魚(yú)類(lèi)卵巢發(fā)育期間對(duì)雌激素的需求相一致；而在腦部，雄激素芳香化變成雌激素是調(diào)節(jié)生理和行為的一個(gè)基本步驟，此時(shí)cyp19b基因的正常表達(dá)至關(guān)重要[14-15].

Chiang[16]研究認(rèn)為斑馬魚(yú)cyp19a基因在卵黃發(fā)生期間主要在濾泡中表達(dá)，其功能可能是參與卵巢中卵泡形成過(guò)程的卵黃發(fā)生，cyp19b主要在丘腦下部、端腦、嗅球中表達(dá)，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的功能、性行為、性別決定產(chǎn)生影響.本研究中大黃魚(yú)cyp19a基因主要在性腺中表達(dá)，在腦部基本沒(méi)有表達(dá)(見(jiàn)圖2)；cyp19b主要在腦部(中腦、端腦、下丘腦)、脾臟、肝臟表達(dá)，在性腺中基本沒(méi)有表達(dá)(見(jiàn)圖3)，這與斑馬魚(yú)、金魚(yú)的研究結(jié)果相似[16-17].對(duì)虹鱒[14]、石斑魚(yú)[18]的研究表明cyp19b主要在腦和垂體中表達(dá)，有明顯的雌、雄差異；cyp19a主要在性腺和垂體表達(dá)，且性腺表達(dá)量遠(yuǎn)高于垂體，無(wú)雌雄差異.另外不同魚(yú)類(lèi)的cyp19a/b在脾臟、腎臟、肝臟、腮中有時(shí)也有表達(dá)，但可能研究魚(yú)的種類(lèi)、年齡、所處發(fā)育狀態(tài)及研究方法不同，表達(dá)模式各有不同[11,14，18-19].但一致的是cyp19a和cyp19b在性腺和腦的表達(dá)存在明顯的組織特異性[20].斑馬魚(yú)中有兩種芳香化酶氨基酸具有60%的同源性，編碼它們的兩個(gè)基因是直系同源基因，由同一祖先基因復(fù)制而產(chǎn)生[16].根據(jù)復(fù)制—退化—互補(bǔ)模型[21]，如果基因被相互退化的基本的組織特異性調(diào)控因子所調(diào)節(jié)，兩個(gè)復(fù)制的基因的功能都會(huì)被保留下來(lái).因此，腦型的cyp19b不能補(bǔ)償卵巢型cyp19a的功能，雌性如果缺乏卵巢型cyp19a就會(huì)不育，這在人類(lèi)和小鼠中已經(jīng)被證實(shí)[22-23].本研究中大黃魚(yú)兩種芳香化酶的氨基酸同源性達(dá)63%，進(jìn)一步同源比較發(fā)現(xiàn)，大黃魚(yú)芳香化酶氨基酸序列與鱸形目魚(yú)類(lèi)相似性高達(dá)85%以上，與鯉形目、鯰形目相似性高達(dá)65%以上(見(jiàn)圖4).這表明大黃魚(yú)兩種芳香化酶基因在進(jìn)化上保守性較高，但在功能上卻又各自獨(dú)立，不可互相替代.cyp19a 和cyp19b表達(dá)模式的不同表明它們具有不同的生理功能，也說(shuō)明在進(jìn)化過(guò)程中這兩個(gè)基因在兩種不同組織中的重要性.

[參考文獻(xiàn)]

[1]徐開(kāi)達(dá)，劉子藩．東海區(qū)大黃魚(yú)漁業(yè)資源及資源衰退原因分析[J]．大連水產(chǎn)學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，22(5)：392-396.

[2]張彩蘭，劉家富，李雅璀，等．福建省大黃魚(yú)養(yǎng)殖現(xiàn)狀分析與對(duì)策[J]．上海水產(chǎn)大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，11(1)：77-83.

[3]VON HOFSTEN J，OLSSON P E．Zebrafish sex determination and differentiation：involvement of FTZ-F1 genes[J]．Reproductive Biology and Endocrinology，2005，3(1)：63-73.

[4]徐跑，俞菊華，唐永凱，等．黃顙魚(yú)卵巢P-450arom基因的克隆及器官表達(dá)[J]．中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)，2005，12(5)：541-548.

[5]KITANO T，TAKAMUNE K，KOBAYASHI T，et al．Suppression of P450 aromatase gene expression in sex reversed males produced by rearing genetically female larvae at a high water temperature during a period of sex differentiation in the Japanese flounder(Paralichthys olivaceus)[J]．Journal of Molecular Endocrinology，1999，23(2)：167-176.

[6]KITANO T，TAKAMUNE K，NAGAHAMA Y，et al．Aromatase inhibitor and 17alpha methyltestost- erone cause sex-reversal from genetical females to phenotypic males and suppression of P450 aromatase gene expression in Japanese flounder(Paralichthys olivaceus)[J]．Molecular Reproduction and Development，2000，56(1)：1-5.

[7]CHOMCZYNSKI P．A reagent for the single-step simultaneous isolation of RNA，DNA and proteins from cell and tissue samples[J]．Biotechniques，1993，15(3)：532-537.

[8]ZHANG Z P，SHEN B L，WANG Y L，et al． Differential expression of proliferating cell nuclear antigen in the developing ovary and testis of penaeid shrimp Marsupenaeus japonicus[J]．DNA and Cell Biology，2010，29(4)：163-170.

[9]SIMPSON E R，MAHENDROO M S， MEANS G D，et al．Aromatase cytochrome P450， the enzyme responsible for estrogen biosynthesis[J]．Endocrine reviews，1994，15(3)：342-355.

[10]LEPHART E D．A review of brain aromatase cytochrome P450[J]．Brain Research Reviews，1996，22(1)：1-26.

[11]PIFERRER F，ZANUY S，CARRILLO M，et al．Brief treatment with an aromatase inhibitor during sex differentiation causes chromosomally female salmon to develop as normal，functional males[J]．Journal of experimental zoology，1994，270(3)：255-262.

[12]CALLARD G V，TCHOUDAKOVA A V，KISHIDA M，et al． Differential tissue distribution,developmental programming,estrogen regulation and promoter characteristics ofcyp19 genes in teleost fish[J]．Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology，2001， 79(1/5)：305-314.

[13]VALLE L D，RAMINA A，VIANELLO S，et al．Cloning of two mRNA variants of brain aromatase cytochrome P450 in rainbow trout(Oncorhynchus mykissWalbaum)[J]．TheJournalofSteroidBiochemistryandMolecularBiology，2002，82(1)：19-32.

[14]TANAKA M，TELECKY T M，F(xiàn)UKADA S，et al．Cloning and sequence analysis of the cDNA encoding P450 aromatase (P450arom) from a rainbow trout(Oncorhynchus mykiss)ovary；relationship between the amount of P450arom mRNA and the production of oestradiol-17β in the ovary[J]．Journal of Molecular Endocrinology，1992，8(1)：53-61.

[15]TANAKA M，F(xiàn)UKADA S，MATSUYAMA M，et al．Structure and promoter analysis of the cytochrome P450 aromatase gene of the teleost fish，medaka(Oryzias latipes)[J]．The Journal of Biochemistry，1995，117(4)：719-725.

[16]CHIANG E F，YAN Y L，GUIGUEN Y，et al．Twocyp19 (P450 aromatase) genes on duplicated zebrafish chromosomes are expressed in ovary or brain[J]．Molecular Biology and Evolution，2001，18(4)：542-550.

[17]GELINAS D，PITOC G A，CALLARD G V．Isolation of a goldfish brain cytochrome P450 aromatase cDNA：mRNA expression during the seasonal cycle and after steroid treatment[J]．Molecular and Cellular Endocrinology，1998，138(1/2)：81-93.

[18]李廣麗，劉曉春，張勇，等．赤點(diǎn)石斑魚(yú)兩種芳香化酶 cDNA 的克隆及其表達(dá)的器官特異性[J]．動(dòng)物學(xué)報(bào)，2004，50(5)：791-799.

[19]KISHIDA M，CALLARD G V．Distinct cytochrome P450 aromatase isoforms in zebrafish(Danio rerio) brain and ovary are differentially programmed and estrogen regulated during early development[J]．Endocrinology，2001，142(2)：740-750.

[20]TCHOUDAKOVA A，CALLARD G V．Identification of multiplecyp19 genes encoding different cytochrome P450 Aromatase isozymes in brain and ovary[J]．Endocrinology，1998，139(4)：2179-2189.

[21]FORCE A，LYNCH M，PICKETT F B，et al．Preservation of duplicate genes by complementary，degenerative mutations[J]．Genetics，1999，151(4)：1531-1545.

[22]SHOZU M，AKASOFU K，HARADA T，et al．A new cause of female pseudohermaphroditism：placental aromatase deficiency[J]．The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism，1991，72(3)：560-566.

[23]FISHER C R，GRAVES K H，PARLOW A F，et al．Characterization of mice deficient in aromatase(arko) because of targeted disruption of thecyp19 gene[J]．Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America(PNAS)，1998，95(2)：6965-6970.

(責(zé)任編輯朱雪蓮英文審校張子平)

Cloning and Expression ofcyp19a/b Gene inLarge Yellow Croaker Larimichthys croceaCHEN Yun， ZHOU Peng， ZHANG Zi-ping，XIE Fang-jing， CAI Ming-yi， WANG Yi-lei

(Fisheries College,Jimei University,Xiamen 361021,China)

Abstract:Gonad development is dependent on balance between estrogen and androgen,which is regulated by expression of the cyp19 gene and its product aromatase cytochrome P450.Two cyp19 genes named as cyp19a and cyp19b have been identified in fish. In this study,both the cyp19a and cyp19b have been cloned from Larimichthys crocea.The cDNA of cyp19a gene is 1805bp in length (NCBI：FJ800566),including the 1557bp open reading frame (ORF) which codes a polypeptide of 518 amino-acid.The cDNA of cyp19b gene is 2268bp in length (NCBI:FJ800567),including the 1503bp ORF which codes a polypeptide of 500 amino-acid.Real-time PCR results show that the expression level of cyp19a in ovary is significantly higher than in testis.And the expression level of cyp19a in gonad is higher than other tissues.The expression level of cyp19b gene in brain,spleen and liver is higher than in gonad,muscle,and kidney.

Key words:cyp19a/b gene；aromatase；gonad；gene expression

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[中圖分類(lèi)號(hào)]Q 343.1+5

[文章編號(hào)]1007-7405(2015)02-0081-09

[作者簡(jiǎn)介]陳蕓(1978—)，女，講師，博士，主要從事分子遺傳學(xué)研究.通訊作者：王藝?yán)?1963—)，女，教授，博士，E-mail：ylwang@jmu.edu.cn.

[基金項(xiàng)目]國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31272653)；福建省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2011J05082)；集美大學(xué)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)基金資助項(xiàng)目(2010A001)

[收稿日期]2014-03-10[修回日期]2014-06-26