王紅娟，安彩霞，胡雯，張德志，普雄明

（新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院，烏魯木齊830001）

白癜風(fēng)是一種常見的色素減退性疾病，發(fā)病機(jī)制尚不清楚，治療困難[1-2]。在現(xiàn)階段治療白癜風(fēng)的方法主要有物理療法、藥物療法及外科療法。如果白斑處黑素細(xì)胞完全喪失則采用傳統(tǒng)的藥物和物理治療方法難以復(fù)色，此時(shí)需要外科治療將自體黑素細(xì)胞移入白斑區(qū)域。外科療法主要包括自體表皮移植、自體表皮黑素細(xì)胞懸液移植和自體黑素細(xì)胞體外培養(yǎng)移植等方法[3]。但自體表皮移植和自體表皮黑素細(xì)胞懸液移植受患者皮損面積的限制，而自體黑素細(xì)胞經(jīng)體外擴(kuò)增后，很小面積的表皮即可培養(yǎng)出大量的黑素細(xì)胞，從而治療面積較大的白癜風(fēng)皮損。本研究應(yīng)用自體純培養(yǎng)黑素細(xì)胞移植治療了43 例穩(wěn)定期白癜風(fēng)患者，探討不同分型和不同部位白癜風(fēng)患者的療效差異，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 43 例穩(wěn)定期白癜風(fēng)患者（男18 例，女25 例），年齡10～59 歲（平均28．83 歲），病程1～20 年，面積2～130 cm2。臨床類型：散發(fā)型14 例，節(jié)段型14 例，局限型15 例。共有皮損87 塊，其中面頸部18 塊，軀干24 塊，四肢45 塊。移植前1 年病情穩(wěn)定，均有藥物或中波紫外線（UVB）治療史，療效不佳，無其他自身免疫?。ㄈ缂谞钕偌膊?、紅斑狼瘡等），無疤痕體質(zhì)等。試驗(yàn)方案經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 試劑 M2 黑素細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基[DEMEM/F12，含5 μg/L 堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF），購自Promocell 公司]，0.25%胰酶（含0.02%EDTA），胎牛血清（購自Gibco 公司）。S-100 單克隆抗體，左旋多巴（L－Dopa，購自Sigma 公司）。

1.3 方法

1.3.1 黑素細(xì)胞的分離培養(yǎng) 使用表皮分離吸皰儀在白癜風(fēng)患者腹部正常皮膚處吸皰6 個(gè)（負(fù)壓50kPa，時(shí)間60~90 min，每個(gè)皰直徑0.8 cm），皮膚發(fā)皰后，用注射器將皰液吸出，放入5 mL 離心管中，0.22 μm針頭濾器過濾，-20 ℃保存?zhèn)溆?。沿皰壁基底邊緣剪下皰壁，加入含雙抗（青霉素和鏈霉素）100 U/mL 的PBS，室溫放置10 min，加入PBS 洗2~3 次，將PBS吸干凈，組織剪碎，加入0.25%胰酶放入4 ℃消化12~16 h，胎牛血清終止消化，吹打使細(xì)胞分散，試管內(nèi)液體混濁后1 500 r/min 離心3 min 棄上清，緩沖液沖洗后再次離心和棄上清，加入M2 黑素細(xì)胞選擇性培養(yǎng)基中，置37 ℃，5%二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每3 天更換培養(yǎng)液1 次，并在顯微鏡下觀察黑素細(xì)胞生長(zhǎng)及增殖狀況，當(dāng)黑素細(xì)胞融合后，進(jìn)行傳代。

1.3.2 黑素細(xì)胞的鑒定

1.3.2.1 L-DOPA 染色 調(diào)整黑素細(xì)胞濃度為4×104個(gè)/mL，接種于放有蓋玻片的6 孔板中，待細(xì)胞爬滿蓋玻片80%時(shí)，取出蓋玻片，用冰PBS 洗2 次，5%的甲醛固定30 min，再用冰PBS 洗2 次，加入0.1%左旋多巴磷酸鹽緩沖液（pH7.4），放入37 ℃溫箱中溫浴4 h，棄去多巴液，觀察細(xì)胞顯色程度。

1.3.2.2 抗S-100 免疫細(xì)胞化學(xué)染色 將細(xì)胞爬片置于載玻片上，用95%的乙醇固定10 min，自然干燥，PBS 液沖洗1 次，滴加TritonX-100 室溫下10 min，滴加1 滴3%H2O2室溫下10 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，PBS 液沖洗3 次，滴加1 滴一抗鼠抗S-100 蛋白單克隆抗體，4 ℃過夜。滴加二抗山羊抗小鼠IgG 抗體-HRP 多聚體，加DAB 顯色5 s，沖洗，復(fù)染，脫色，透明，封片即完成。

1.3.3 黑素細(xì)胞的移植 黑素細(xì)胞用胰酶消化，收集，PBS 洗3 次，用患者皰液混懸黑素細(xì)胞（8 μL/cm2），每位患者可獲得皰液為1~2 mL。白斑區(qū)常規(guī)消毒，超脈沖二氧化碳激光磨削，深度以可見點(diǎn)狀毛細(xì)血管出血為度，將混懸的黑素細(xì)胞種植于移植區(qū)創(chuàng)面，細(xì)胞密度為（8～14）×104個(gè)/cm2，油紗布覆蓋創(chuàng)面，外敷含有患者皰液的無菌紗布，待患者平臥休息1 h 后用無菌敷料包扎，7~10 d 后去除紗布。

1.4 臨床療效判斷標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)白癜風(fēng)臨床分型及療效標(biāo)準(zhǔn)《草案》。痊愈：色素恢復(fù)>90%為痊愈。顯效：白斑部分消失或縮小，恢復(fù)正常膚色面積占皮損面積50%~90%。好轉(zhuǎn)：白斑部分減退或縮小，恢復(fù)正常膚色面積占皮損面積10%~49%。無效：白斑無變化或縮小，恢復(fù)正常膚色面積占皮損面積<10%。有效率＝（痊愈＋顯效）/總塊數(shù)×100%。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理，各組間比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 白癜風(fēng)患者黑素細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定 將組織剪碎，胰酶消化，細(xì)胞混懸液放入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，開始細(xì)胞形態(tài)都是小圓點(diǎn)狀，并且有大量漂浮的細(xì)胞，培養(yǎng)1 周左右，一部分細(xì)胞逐漸由圓形變成梭型，并有2～3 個(gè)樹突，約2 周后，黑素細(xì)胞數(shù)量明顯增多，連接成網(wǎng)狀，細(xì)胞內(nèi)充滿黑素顆粒，細(xì)胞呈梭形。原代細(xì)胞呈多極性、有折光性的纖維樣細(xì)胞，傳代細(xì)胞多為雙極性、細(xì)長(zhǎng)、平行排列。L-DOPA 染色：細(xì)胞胞質(zhì)及樹突呈黑色或棕褐色，呈陽性反應(yīng)，見圖1，S-100 免疫細(xì)胞化學(xué)染色呈陽性，證實(shí)為成熟的黑素細(xì)胞，可正常合成黑素。

圖1 黑素細(xì)胞（L-DOPA染色×40）

2.2 白癜風(fēng)患者療效觀察 移植4 個(gè)月以上觀察療效，隨訪時(shí)間最長(zhǎng)12 個(gè)月，平均隨訪時(shí)間為8 個(gè)月。43 例穩(wěn)定期白癜風(fēng)患者，平均種植面積為23 cm2，25例復(fù)色面積超過90%，見圖2～4。痊愈率為58.14%，11 例復(fù)色面積50%~90%，有效率為83.72%。87 塊皮損中，有51 塊皮損獲得了90%以上的復(fù)色，痊愈率為58.62%，74 塊皮損獲得了50%以上的復(fù)色，有效率為85.05%。

圖2 腿部白癜風(fēng)患者移植前后皮損變化

圖3 腰部白癜風(fēng)患者移植前后皮損變化

圖4 面部白癜風(fēng)患者移植前后皮損變化

2.3 不同臨床分型患者移植后療效比較 43 例中，散發(fā)型14 例，痊愈率為42.86%，有效率71.43%；節(jié)段型14 例，痊愈率57.14%，有效率85.71%；局限型15 例，痊愈率73.33%，有效率93.33%。不同分型患者的痊愈率比較：局限型患者的療效高于節(jié)段型和散發(fā)型，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2分別為17.405、25.745，均P＜0.05）。見表1。

表1 不同臨床分型白癜風(fēng)患者移植后療效比較 例

2.4 不同部位移植后療效比較 共移植皮損87 塊，其中面頸部18 塊，痊愈率為77.78%，有效率88.89%；軀干24 塊，痊愈率45.83%，有效率79.17%；四肢45塊，痊愈率57.78%，有效率86.67%。面頸部的療效顯著高于軀干和四肢，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2分別為24.915 和12.076，均P＜0.05）。見表2。

表2 不同部位白癜風(fēng)患者移植后療效比較 塊

2.5 不良反應(yīng) 供皮區(qū)未發(fā)生同形反應(yīng)現(xiàn)象，其中有3 例患者恢復(fù)一段時(shí)間后有色沉，見圖3，隨著時(shí)間推移逐漸變淡。這可能是由于這3 例患者在黑素細(xì)胞種植時(shí)單位面積滴加的細(xì)胞數(shù)相對(duì)較高。

3 討論

黑素細(xì)胞在普通培養(yǎng)基中很難生長(zhǎng)，這是因?yàn)檎Ｆつw中黑素細(xì)胞數(shù)量很少，約占表皮細(xì)胞的2%～4%，其增殖能力較角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞弱，體外培養(yǎng)的黑素細(xì)胞早期常因角質(zhì)形成細(xì)胞或成纖維細(xì)胞的過度生長(zhǎng)而失敗。因此體外培養(yǎng)黑素細(xì)胞培養(yǎng)液中的添加成分對(duì)黑素細(xì)胞的生長(zhǎng)起重要作用。為了使黑素細(xì)胞能在體外連續(xù)傳代培養(yǎng)，早期的培養(yǎng)基中含有十四酰佛波醇乙酸酯（TPA）、霍亂毒素（CT）、異丁酰甲基黃嘌呤（IMBX）及牛腦垂體提取物（BPE）等促進(jìn)細(xì)胞分裂或生長(zhǎng)劑。TPA是一種強(qiáng)有絲分裂促進(jìn)劑，不排除有致癌的危險(xiǎn)性，CT 有毒性作用，BPE 也存在一定的風(fēng)險(xiǎn)。因此，科研工作者以DMEM/F12 作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，加入了一定濃度的堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子bFGF 及其他成分，成功培養(yǎng)了黑素細(xì)胞[4]。市售的以此成分為主的黑素細(xì)胞專用培養(yǎng)基有ScienCell 公司的Melanocyte Medium-2（MelM－2）和Promocell 公司的M2。MelM-2 不含有TPA，但含有一些必需和非必需氨基酸、維生素、其他有機(jī)物質(zhì)、微量元素和無機(jī)鹽、激素和生長(zhǎng)因子等，使用時(shí)需添加黑素細(xì)胞生長(zhǎng)添加劑MelGS-2（不含TPA）和少量的胎牛血清，但此培養(yǎng)基含有牛垂體提取物（BPE）。M2 培養(yǎng)基包括DMEM/F-12，使用時(shí)只含有堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子[5]，是一種高平衡、不添加TPA 的無血清培養(yǎng)基，黑素細(xì)胞培養(yǎng)效果比較理想，其生物學(xué)安全性較高。此外，本研究采用負(fù)壓吸皰皰液來混懸黑素細(xì)胞，種植于白斑處，這樣有可能提高黑素細(xì)胞移植后的生物安全性和成活率。

自體黑素細(xì)胞移植是一種治療白癜風(fēng)的有效方法，適用于傳統(tǒng)方法治療無效的穩(wěn)定期白癜風(fēng)患者。1987 年Lerner 等[6]首次應(yīng)用培養(yǎng)的自體黑素細(xì)胞移植治療白癜風(fēng)獲得成功，此后國內(nèi)外相繼開展此類研究，國內(nèi)最早則由徐小珂等[7]于1996 年報(bào)道。本研究采用負(fù)壓吸皰獲取患者正常表皮片，制成細(xì)胞懸液經(jīng)2～5 次傳代后收集黑素細(xì)胞，白斑區(qū)用超脈沖CO2激光磨削后進(jìn)行黑素細(xì)胞移植（43 例患者在移植后均未進(jìn)行其他輔助治療），隨訪觀察復(fù)色效果，痊愈率為58.14%，有效率為83.72%。本研究結(jié)果表明，白癜風(fēng)臨床分型和白斑部位可影響自體黑素細(xì)胞移植的療效，其中局限型白癜風(fēng)治療效果明顯好于節(jié)段型和散發(fā)型，這與姚蕾等[8]的研究結(jié)果基本類似。面頸部治療效果最好，其次為四肢和軀干，這與Hong 等[9]的研究結(jié)果類似?？傊泽w純培養(yǎng)黑素細(xì)胞移植是治療穩(wěn)定期白癜風(fēng)的有效治療手段，其移植療效與白癜風(fēng)類型和皮損部位密切相關(guān)。

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