周麗娜，王洪新

帕金森病(Parkinson's disease，PD)是中老年人常見的一種以運(yùn)動(dòng)遲緩、強(qiáng)直、靜止性震顫和姿勢(shì)反射障礙為主要臨床癥狀的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。腦深部電刺激術(shù)(deep brain stimulation，DBS)是將電極埋植于腦深部特定的神經(jīng)核團(tuán)，通過顱外腦刺激器發(fā)生電脈沖刺激來達(dá)到治療目的。法國(guó)的Benabid 醫(yī)生最初在作核團(tuán)毀損術(shù)前用100～180 Hz 高頻刺激來測(cè)定手術(shù)毀損范圍時(shí)，發(fā)現(xiàn)高頻刺激可使PD 癥狀改善，頻率較低時(shí)則沒有此效果，從而開創(chuàng)了腦深部電刺激術(shù)［1］。目前手術(shù)常用靶點(diǎn)有丘腦底核(subthalamic nucleus，STN)、蒼白球內(nèi)側(cè)核(globus pallidus internus，GPi)和丘腦腹中間核(ventral intermediate nucleus，Vim)，其中STN-DBS 對(duì)震顫、強(qiáng)直、運(yùn)動(dòng)遲緩和異動(dòng)癥的治療效果最為顯著，能顯著減少用藥劑量，并具有非破壞性、可調(diào)節(jié)性、可逆性和并發(fā)癥少等優(yōu)點(diǎn)，是最為理想的刺激靶點(diǎn)。雖然STN-DBS 的臨床效果得到肯定，但其作用機(jī)理仍不十分清楚?；诖?，本研究選用STN 為研究對(duì)象，記錄正常大鼠和帕金森病大鼠STN-DBS 前后STN 的細(xì)胞外放電，分析了其放電頻率和放電形式，來進(jìn)一步的探討高頻電刺激STN 治療PD 的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 動(dòng)物 選用健康雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠30 只，質(zhì)量260～290 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司［動(dòng)物許可證號(hào):SXCK(京)2002-0003］提供。大鼠在標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境飼養(yǎng)，室溫20～28 ℃，24 h 晝夜循環(huán)光照，自由飲水進(jìn)食。動(dòng)物經(jīng)行為學(xué)測(cè)試無旋轉(zhuǎn)行為后進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。將大鼠隨機(jī)分為2 組:正常對(duì)照組(n=10)、帕金森病模型組(n=20)。

1.1.2 儀器 腦立體定位儀(美國(guó))、牙科鉆(STRONG 90)(韓國(guó))、DigiData 1322A 型生物電信號(hào)采集與分析系統(tǒng)(美國(guó)Axon 公司)、微電極放大器(AxoClamp-2B)(美國(guó)Axon 公司)、手術(shù)顯微鏡(YZ20P5)(美國(guó))、微電極推進(jìn)器(MS314)(美國(guó)Axon 公司)、光學(xué)顯微鏡(日本Olympus 公司)、電刺激器(SEN-7203)(日本SEN 公司)。

1.1.3 試劑 水合氯醛、烏拉坦、氯化鉀、6-羥多巴胺(6-hydroxydopamine，6-OHDA)、阿樸嗎啡(Apomorphine，APO)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 帕金森病大鼠模型的建立 采用6-OHDA 化學(xué)性毀損黑質(zhì)致密部(substantia nigra compacta，SNc)的多巴胺能神經(jīng)元的方法建立PD 模型。首先將2 mg 6-OHDA 溶于700 μl 含0.2%抗壞血酸的生理鹽水中(濃度約為3 mg/ml)，并置于冰盒內(nèi)，避光保存。將SD 大鼠用10%的水合氯醛(3 ml/kg)腹腔注射麻醉后，將其俯臥位固定于腦立體定位儀上。沿頭頂部正中切開頭皮和皮下組織，暴露前囟。采用兩點(diǎn)注射法，根據(jù)包新民等［2］著的大鼠腦立體定位圖譜，選擇左側(cè)SNc 兩點(diǎn)坐標(biāo)分別為:前囟后5 mm，中線旁開1.9 mm，硬膜下8.0 mm 和前囟后5 mm，中線旁開1.8 mm，硬膜下8.0 mm。做好標(biāo)記后用牙科鉆沿兩點(diǎn)周圍開一小骨瓣，并在手術(shù)顯微鏡下掀除硬腦膜，暴露腦組織。用10 μl Hamilton 微量注射器通過立體定位注射儀每點(diǎn)注射6-OHDA 溶液4 μl(12 μg)，注射速度為l μl/min，留針10 min，而后緩慢退針，消毒后縫合皮膚。腹腔注射青霉素100000 IU 預(yù)防感染。將術(shù)后的大鼠置于安靜保溫處直至清醒，自由進(jìn)食飲水。毀損4 w 后，給大鼠腹腔注射APO(0.5 mg/kg)誘發(fā)旋轉(zhuǎn)行為。于注藥后5 min 內(nèi)出現(xiàn)向健側(cè)(毀損對(duì)側(cè))旋轉(zhuǎn)，身體呈環(huán)形，首尾相接，并且30 min 內(nèi)平均速度大于7圈/分為成功的帕金森病大鼠模型。

1.2.2 STN 電刺激 電生理記錄在APO 誘發(fā)后2 w 進(jìn)行，將兩組大鼠用30%烏拉坦(1.0 g/kg)腹腔麻醉后置于立體定向儀上，按包新民等的大鼠腦立體定位圖譜確定右側(cè)STN 坐標(biāo)為前囟后3.4～4.2 mm，中線旁開2.0～3.0 mm，硬膜下7.2～8.3 mm。STN 上方的顱骨和硬腦膜被小心移除，把一尖端直徑為200 μm 的同心圓刺激電極通過立體定向方法，在矢狀面上垂直前傾20°插入STN。通過刺激器進(jìn)行電刺激，刺激參數(shù)為頻率130 Hz，波寬0.06 ms，電流強(qiáng)度0.4 mA，刺激時(shí)間10 s。

1.2.3 STN 神經(jīng)元細(xì)胞外記錄 采用玻璃微電極細(xì)胞外記錄法記錄STN 刺激前120～180 s，刺激中(10 s)和刺激后120～180 s 的STN 神經(jīng)元放電。電極尖端直徑1～2 μm，阻抗10～20 MΩ，充灌液為含1%滂胺天藍(lán)的3 mol/L 氯化鉀溶液。細(xì)胞放電經(jīng)微電極放大器(AxoClamp-2B)和生物電信號(hào)采集與分析系統(tǒng)顯示于計(jì)算機(jī)，做實(shí)時(shí)觀察、儲(chǔ)存，而后用Spike2 軟件分離出信噪比大于或等于3∶ 1的信號(hào)進(jìn)行信號(hào)分析。進(jìn)行信號(hào)分析。采樣時(shí)間5～20 min。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中將大鼠直腸溫度維持在37 ±0.5 ℃。每組記錄結(jié)束后，給予20 μA 陰極電流10～15 min，微電泳滂胺天藍(lán)到最后一個(gè)記錄位點(diǎn)。

1.2.4 組織學(xué)定位及形態(tài)學(xué)觀察 電生理記錄完畢后，將大鼠在過量麻醉下斷頭取腦，將鼠腦置于4%甲醛溶液中24 h。行連續(xù)冠狀石蠟切片，并進(jìn)行HE 染色，以確定記錄點(diǎn)的位置和SNc 毀損情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 對(duì)記錄點(diǎn)在STN 內(nèi)的神經(jīng)元的電活動(dòng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，記錄位置在STN 之外的神經(jīng)元信號(hào)棄之不用。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS11.5 for windows 統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。分析刺激前每個(gè)STN 神經(jīng)元的基礎(chǔ)放電活動(dòng)并計(jì)算平均放電頻率。放電頻率采用表示。通過獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)比較對(duì)照組和PD 組大鼠STN 神經(jīng)元放電頻率，通過χ2檢驗(yàn)比較兩組大鼠STN 神經(jīng)元放電形式，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PD 模型的行為檢測(cè) 進(jìn)行造模的20 只大鼠，12 只誘發(fā)旋轉(zhuǎn)成功，2 只死亡。對(duì)照組大鼠無死亡。

2.2 組織學(xué)檢測(cè) 分別觀察和分析了對(duì)照組大鼠STN 中的42 個(gè)神經(jīng)元和PD 組大鼠STN 中的48 個(gè)神經(jīng)元，病理結(jié)果顯示刺激點(diǎn)和記錄點(diǎn)均位于STN 內(nèi)。成功誘發(fā)的PD 組，毀損區(qū)結(jié)構(gòu)紊亂，SNc神經(jīng)元消失，膠質(zhì)細(xì)胞增生。

2.3 STN 神經(jīng)元自發(fā)放電活動(dòng) 對(duì)照組大鼠神經(jīng)元的放電頻率為16.21 ±1.26 Hz，PD 組大鼠神經(jīng)元放電頻率為17.56 ±1.02 Hz，兩組放電頻率無顯著差異(P ＞0.05)(見表1)。在對(duì)照組大鼠，STN神經(jīng)元表現(xiàn)出3 種放電形式，規(guī)則放電的神經(jīng)元25個(gè)(60%)，不規(guī)則放電的神經(jīng)元11 個(gè)(25%)，爆發(fā)式放電的神經(jīng)元6 個(gè)(15%)。PD 組大鼠STN 神經(jīng)元也表現(xiàn)出3 種放電形式，規(guī)則放電的神經(jīng)元6 個(gè)(14%)，不規(guī)則放電的神經(jīng)元10 個(gè)(20%)，爆發(fā)式放電的神經(jīng)元32 個(gè)(66%)(見圖1)。經(jīng)χ2檢驗(yàn)，對(duì)照組和PD 組大鼠STN 神經(jīng)元放電形式的總體分布不同，PD 組大鼠STN 神經(jīng)元中爆發(fā)放電的神經(jīng)元明顯多于對(duì)照組，而規(guī)則放電的神經(jīng)元顯著少于對(duì)照組(P ＜0.01)(見表1、圖2)。

圖1 對(duì)照組和帕金森病組大鼠STN 神經(jīng)元的放電形式

圖2 對(duì)照組和PD 組大鼠STN 神經(jīng)元放電形式比較

表1 對(duì)照組和PD 組大鼠STN 神經(jīng)元放電形式比較

2.4 電刺激STN 對(duì)STN 神經(jīng)元放電的影響在對(duì)正常對(duì)照組和PD 組STN 高頻刺激過程中，共觀察到4 種不同類型的反應(yīng)(見圖3)。正常對(duì)照組在10 s 的刺激過程中，放電頻率的顯著下降(71%)或甚至完全抑制電活動(dòng)(14%)占絕大多數(shù)。平均放電率由刺激前16.21 ±1.26 Hz 到刺激中的8.34±1.12 Hz。只有5%的神經(jīng)元放電率增加，10%的神經(jīng)元放電率沒有變化。PD 組在電刺激過程中也出現(xiàn)放電率的顯著降低(60%)或完全性抑制(17%)。平均放電率為由刺激前17.56 ±1.02 Hz到刺激中的3.34 ±1.02 Hz。放電率增加的神經(jīng)元上升至6%，17%的神經(jīng)元放電率沒有變化(見表2)。

圖3 高頻電刺激過程中STN 神經(jīng)元的4 種反應(yīng)類型

表2 電刺激STN 對(duì)STN 神經(jīng)元放電的影響

3 討論

STN 在基底節(jié)運(yùn)動(dòng)調(diào)控系統(tǒng)中占據(jù)重要地位。其通過傳入和傳出纖維與大腦皮質(zhì)、蒼白球、黑質(zhì)和腦干等與運(yùn)動(dòng)調(diào)控的相關(guān)結(jié)構(gòu)存在廣泛聯(lián)系。抑制性的蒼白球外側(cè)部(globus pallidus pars externa，GPe)-STN 通路和興奮性的STN-黑質(zhì)網(wǎng)狀部(substantia nigra pars reticularis，SNr)/蒼 白 球 內(nèi) 側(cè) 部(globus pallidus pars interna，Gpi)通路，是STN 主要的生理調(diào)節(jié)系統(tǒng)。因此STN 被描述成基底節(jié)活動(dòng)的“動(dòng)力”源泉。PD 狀態(tài)下在間接通路中，因SNc至紋狀體的多巴胺(dopamine，DA)能通路變性，引起紋狀體神經(jīng)元D2 受體的抑制減弱，于是自紋狀體至GPe 的γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)能作用加強(qiáng)，GPe 處的GABA 能神經(jīng)元受到過分抑制，自GPe 至STN 的GABA 能通路的抑制作用減弱，從而導(dǎo)致STN 的作用過強(qiáng)，又因STN 作用過強(qiáng)就轉(zhuǎn)而引起Gpi/SNr 復(fù)合體對(duì)丘腦抑制性作用加強(qiáng)。導(dǎo)致丘腦對(duì)皮質(zhì)運(yùn)動(dòng)區(qū)的興奮作用減弱，故PD患者運(yùn)動(dòng)減少、肌強(qiáng)直、平衡障礙、姿勢(shì)異常和語音低沉。還有研究表明STN 高興奮性可是SNc 放電產(chǎn)生同步化效應(yīng)，導(dǎo)致SNc 多巴胺能神經(jīng)元釋放DA 增加，暫時(shí)維持腦內(nèi)直接通路與間接通路的相互平衡，而STN 興奮性傳出纖維過度釋放谷氨酸(glutamic acid，Glu)，促進(jìn)DA 能神經(jīng)元的損傷，從而加速PD 癥狀的發(fā)展［3］。因此STN 的過度活性和其傳出靶區(qū)的過度興奮現(xiàn)在已被認(rèn)為是PD 的病理生理標(biāo)志。

近十年來，STN 的高頻電刺激術(shù)(high-frequency stimulation，HFS)正被越來越多的用于治療PD。雖然其的臨床效果得到肯定，但其作用機(jī)理仍不十分清楚。目前認(rèn)為DBS 治療帕金森病的可能機(jī)制有［4～6］:(1)DBS 能提高紋狀體區(qū)多巴胺的代謝活性，并增加乙酰膽堿M 受體從STN 轉(zhuǎn)移到丘腦，提高丘腦乙酰膽堿的濃度。(2)DBS 能增加丘腦、小腦、中腦和皮質(zhì)區(qū)域的血流量。(3)DBS 能抑制從STN 到其他靶點(diǎn)投射的谷氨酸神經(jīng)纖維的活性，降低興奮性神經(jīng)元的過度激活。(4)DBS 能對(duì)異常STN 神經(jīng)元興奮性的調(diào)控，改變相關(guān)的聯(lián)系核團(tuán)的異常功能狀態(tài)，使基底核運(yùn)動(dòng)環(huán)路正常調(diào)控功能重新恢復(fù)。

基于以上研究的基礎(chǔ)，本研究選用6-OHDA 單側(cè)毀損制備的旋轉(zhuǎn)PD 大鼠模型，探討STN-DBS 治療帕金森病的機(jī)制。本研究結(jié)果表明，電刺激前PD模型大鼠STN 神經(jīng)元放電頻率與對(duì)照組無顯著差異，而放電形式發(fā)生改變，正常大鼠大部分STN 神經(jīng)元表現(xiàn)為規(guī)則或不規(guī)則放電，PD 模型大鼠爆發(fā)放電的神經(jīng)元顯著增多，這和既往的研究結(jié)果基本一致。在同樣的放電頻率下，爆發(fā)放電比規(guī)則放電更有效，因此爆發(fā)放電可以說是高興奮性，進(jìn)一步證實(shí)了PD 狀態(tài)下STN 神經(jīng)元的過度活性。同時(shí)本研究表明，高頻電刺激兩組大鼠丘腦底核神經(jīng)元后，兩組丘腦底核神經(jīng)元放電都主要表現(xiàn)為部分抑制或完全抑制，與以往的研究結(jié)果有較好的一致性［7，8］。該研究結(jié)果支持了高頻刺激可失活刺激點(diǎn)附近的神經(jīng)細(xì)胞，抑制丘腦底核的異常放電活動(dòng)，這可能是腦深部電刺激治療帕金森病的可能機(jī)制之一。本實(shí)驗(yàn)提示HFS-STN 可能通過抑制STN 的過度活性而改善帕金森病的癥狀。

綜上，本研究采用細(xì)胞外單位記錄的方法記錄刺激前和刺激過程中丘腦底核神經(jīng)元的放電，結(jié)果表明爆發(fā)式放電增多可能是帕金森發(fā)病潛在的電生理基礎(chǔ)，高頻電刺激丘腦底核可抑制丘腦底核的異常放電活動(dòng)，這可能是腦深部電刺激治療帕金森病的可能機(jī)制之一。但基底節(jié)神經(jīng)環(huán)路相當(dāng)復(fù)雜，有關(guān)帕金森病的病理生理學(xué)機(jī)制及HFS-STN 治療帕金森病的機(jī)制還有待更深入的研究。

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