趙丹華，才麗娜，楊 旭，李繼來，杜繼臣

Pompe 病，又稱糖原累積病Ⅱ型(GSDⅡ)，是一種罕見的常染色體隱性遺傳的溶酶體貯積病，為編碼酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)的基因突變導(dǎo)致溶酶體內(nèi)糖原分解障礙并廣泛沉積于全身所致［1］。根據(jù)發(fā)病年齡、受累器官及疾病進(jìn)展情況，可將Pompe病患者分為嬰兒型(infantile-onset Pompe disease，IOPD)及晚發(fā)型(late-onset Pompe disease，LOPD)兩種。典型的IOPD 患者生后數(shù)月即發(fā)病，主要表現(xiàn)為心臟擴(kuò)大、肌張力低下及呼吸窘迫，2 歲前死亡;而LOPD 患者1 歲后發(fā)病，又可分為兒童型、青少年型及成人型，主要表現(xiàn)為中軸肌及四肢骨骼肌無力，部分伴隨骨骼及心腦血管病變［1～3］。目前臨床上對LOPD 的認(rèn)識不足，導(dǎo)致許多患者從就診到確診的時間長于5 y［4］。在此，我們對1 例LOPD 患者的臨床表現(xiàn)、病理改變及分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)進(jìn)行了詳細(xì)的研究。

1 材料和方法

1.1 臨床資料 23 歲女性，主因“腹脹1 w，加重伴憋氣3 d”就診?；颊哂谌朐呵? w 無明顯誘因出現(xiàn)腹脹、腹圍增加，4 d 后加重，伴胸悶、憋氣，不能平臥。外院查腹部B 超提示腹水(深度5.1 cm);心電圖示:竇性心律，順鐘向轉(zhuǎn)位，電軸右偏;超聲心動示:右心增大(右房橫徑44 mm，右室橫徑37 mm)伴三尖瓣關(guān)閉不全，肺動脈高壓(52 mm-Hg)，左室射血分?jǐn)?shù)69%，少量心包積液;胸片示:雙下肺紋理增粗、模糊，心影略飽滿。臨床診斷為肺動脈高壓，右心功能不全，給予利尿等治療，癥狀一度好轉(zhuǎn)，后又加重。為求進(jìn)一步診治收入我院心內(nèi)科。入院當(dāng)日患者神志清楚，無明顯憋氣，自行步入病房。查血?dú)夥治鍪?pH 7.334，PaO233 mmHg，PaCO284 mmHg，SpO256%，提示Ⅱ型呼吸衰竭。予低流量吸氧、利尿及興奮呼吸等治療無效，患者PaCO2進(jìn)行性升高，意識水平逐漸下降，復(fù)查血?dú)夥治鍪緋H 7.029，PO248 mmHg，PCO2＞130 mmHg，SpO285%。遂立即給予氣管插管，呼吸機(jī)輔助呼吸，0.5 h 后神志轉(zhuǎn)清，復(fù)查血?dú)夥治龌謴?fù)正常。此后患者病情穩(wěn)定，復(fù)查超聲心動示右心室大小及肺動脈壓力均降至正常，腹部B 超未見腹水，且呼吸機(jī)參數(shù)逐漸下調(diào)至可脫機(jī)水平，但拔管撤機(jī)后患者很快出現(xiàn)明顯的呼吸費(fèi)力，指尖氧飽和度迅速下降至70%以下，故再次予氣管插管，呼吸機(jī)輔助呼吸。此后患者始終維持壓力支持通氣模式(壓力支持8 mmHg，吸入氧濃度30%)，多次嘗試脫機(jī)均失敗。

為明確病因，進(jìn)一步追問病史，發(fā)現(xiàn)患者3 y 前出現(xiàn)雙下肢活動后易疲勞癥狀，緩慢加重，但不影響生活及工作;6 m 前家人發(fā)現(xiàn)其睡眠中呼吸節(jié)律較慢，有張口呼吸及聳肩動作。患者父母非近親結(jié)婚，家族史陰性。神經(jīng)系統(tǒng)查體示四肢近端肌力4 級，遠(yuǎn)端5 級，四肢肌容積顯著減少，體質(zhì)指數(shù)(BMI)13.7 kg/m2。肌酶無異常。干血片法檢測患者外周血GAA 酶活性為5.98 pmol/punch/hr(正常參考范圍20～40 pmol/punch/hr)。

1.2 研究方法

1.2.1 骨骼肌病理檢查 經(jīng)知情同意，對患者行右股四頭肌活體組織檢查。肌肉標(biāo)本進(jìn)行常規(guī)組織學(xué)和酶組織化學(xué)染色，染色方法包括:蘇木精-伊紅(HE)、改良Gomori 染色、高碘酸Schiff 反應(yīng)(PAS)、油紅“O”脂肪染色、三磷酸腺苷酶、還原型輔酶I 四氮唑還原酶(NADH)、琥珀酸脫氫酶(SDH)、細(xì)胞色素氧化酶(COX)、非特異性酯酶(NSE)染色。

1.2.2 基因檢查 采集患者4 ml 靜脈血并提取基因組DNA。PCR 反應(yīng)擴(kuò)增GAA 基因1～20 號外顯子及其側(cè)翼序列，PCR 產(chǎn)物送北京華大中生科技發(fā)展有限公司，用ABI3730XL 型DNA 全自動測序儀進(jìn)行直接測序。所有PCR 產(chǎn)物均進(jìn)行雙向測序。對發(fā)現(xiàn)的新突變在100 例正常對照中進(jìn)行篩查。

1.2.3 逆轉(zhuǎn)錄 用TRIzol 試劑一步法提取患者總RNA，在M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶作用下反轉(zhuǎn)錄得到第一鏈cDNA。以cDNA 為模板進(jìn)行PCR 反應(yīng)，使用Primer 3 設(shè)計(jì)引物覆蓋第9、10 號外顯子全長及部分11 號外顯子，(正向引物:5'CGTTCAACAAGGATGGCTTC 3’，反向引物5'GTGGGTTCTCCAGCTCATTG 3’)。應(yīng)用瓊脂糖凝膠檢測PCR 產(chǎn)物并進(jìn)行雙向測序。

2 結(jié)果

骨骼肌主要病理改變?yōu)榧±w維內(nèi)出現(xiàn)大量嗜堿性空泡，部分空泡內(nèi)可見PAS 深染物質(zhì)沉積(見圖1)，未見脂肪滴成分，空泡肌纖維累及兩型，以Ⅱ型肌纖維為主，部分肌纖維內(nèi)出現(xiàn)NSE 深染物質(zhì)沉積，上述病理改變提示GSDⅡ可能。

GAA 基因分析顯示，患者第16 號外顯子上存在c.2238G ＞C 突變，為已報道的致病性突變;第10 號內(nèi)含子存在c.1551 +3_c.1551 +6delAAGT缺失突變(見圖2)，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄PCR 證實(shí)該突變可以導(dǎo)致mRNA 上第10 號外顯子丟失，其編碼的38 個氨基酸(p.480-517)被跨越，產(chǎn)生截短蛋白(見圖3)，進(jìn)一步在100 例正常對照者中均未檢測到該缺失突變。

圖1 患者的骨骼肌病理結(jié)果

圖2 患者GAA 基因測序分析

圖3 患者逆轉(zhuǎn)錄PCR 產(chǎn)物凝膠電泳及測序分析

3 討論

本例患者青年發(fā)病，主要表現(xiàn)為嚴(yán)重呼吸功能障礙及輕度四肢近端無力，外周血白細(xì)胞GAA 酶活性低于正常對照的30%，肌肉活檢顯示空泡性肌病，部分空泡內(nèi)可見PAS 深染物質(zhì)沉積，故診斷為LOPD。GAA 基因檢測顯示患者存在c.2238G ＞C及c.1551 +3_c.1551 +6delAAGT 復(fù)合雜合突變，進(jìn)一步從基因水平上確診該病。結(jié)合其發(fā)病年齡，該患者屬于成年型。

肢帶型肌無力伴呼吸肌力弱是LOPD 患者最常見的臨床表型［3］。本例患者在疾病早期即出現(xiàn)了呼吸衰竭，而肢體運(yùn)動功能相對保留，提示其呼吸肌受累較四肢骨骼肌更嚴(yán)重。有研究表明，部分LOPD 患者以呼吸困難為首發(fā)癥狀，發(fā)病數(shù)年后才喪失行走能力，甚至有個別患者可以通過使用便攜式呼吸機(jī)自己步行到醫(yī)院復(fù)診［4，5］。由此可見，LOPD 患者呼吸功能障礙突出。但是，也有部分患者首先出現(xiàn)肢體無力，坐輪椅10 余年后方才需要使用呼吸機(jī)。因此，LOPD 患者在呼吸肌和骨骼肌受累的順序方面存在很大異質(zhì)性，其呼吸肌功能與四肢肌力之間無相關(guān)性［4，6］。

Pompe 患者的呼吸功能障礙主要表現(xiàn)為限制型通氣障礙，以吸氣肌無力突出，尤其是膈?。?］。膈肌力弱首先表現(xiàn)為臥位肺活量較立位明顯下降，導(dǎo)致夜間低通氣及高碳酸血癥，繼而出現(xiàn)睡眠呼吸障礙、清晨頭痛及白天睡眠過多等不適。本例患者在就診前有入睡后張口呼吸及聳肩等表現(xiàn)，提示當(dāng)時已存在夜間呼吸困難，但未引起注意。隨著疾病的進(jìn)展，呼吸肌力逐漸下降，LOPD 患者白天肺活量亦下降，出現(xiàn)低氧血癥、肺心病及呼吸衰竭［8～10］。本患者在就診時亦存在明確的肺動脈高壓、右心功能不全及呼吸衰竭表現(xiàn)，其臨床特點(diǎn)符合該病的發(fā)展規(guī)律。雖然有文獻(xiàn)報道LOPD 患者存在肺靜脈閉塞病(PVOD)，是導(dǎo)致肺高血壓的原因［11］，但本患者的肺動脈收縮壓在糾正了低氧及高碳酸血癥之后降至正常，故推測缺氧等可逆性因素在其肺高血壓的形成過程中發(fā)揮了更大的作用。

脊柱強(qiáng)直綜合征伴低體重是LOPD 患者另一種常見的臨床表型［3］。本例患者僅有BMI 過低，而沒有脊柱強(qiáng)直表現(xiàn)。LOPD 患者出現(xiàn)BMI 過低，推測可能與以下幾種因素有關(guān):疾病本身導(dǎo)致的吞咽困難、胃腸功能障礙、嚴(yán)重的肌肉萎縮及呼吸功能障礙。因?yàn)殚L期的呼吸功能不全會導(dǎo)致體內(nèi)能量的過度消耗，繼而引起B(yǎng)MI 明顯下降，而給予酶替代治療后，隨著肌力的改善，患者BMI 指數(shù)亦增加［12］。但也有文獻(xiàn)報道酶替代治療不能改善LOPD 患者的BMI，并認(rèn)為BMI 過低是其預(yù)后不良的指標(biāo)之一［11］。

GAA 基因全長28kb，包含20 個外顯子，共編碼952 個氨基酸［2］。目前已報道該基因突變300 余種(www.pompecenter.nl)。本例患者存在c.2238G＞C 及c.1551 +3_c.1551 +6delAAGT 復(fù)合雜合突變。其中，c.2238G ＞C 點(diǎn)突變?yōu)橐褕蟮赖闹虏⌒酝蛔?，也是中國?nèi)地及中國臺灣LOPD 患者的熱點(diǎn)突變［2，13，14］;而c.1551 +3_c.1551 +6delAAGT 缺失突變?yōu)樾峦蛔?，該突變?dǎo)致mRNA 上第10 號外顯子缺失，其所編碼的38 個氨基酸被跨越。由于p.470-517 位于該蛋白的催化結(jié)構(gòu)域，其后連接活性中心D518，且N470 也是蛋白翻譯后進(jìn)行糖基化修飾的7 個位點(diǎn)之一［15］，因此推測10 號外顯子缺失將對蛋白的結(jié)構(gòu)和催化功能產(chǎn)生重要影響;同時，在100 例健康對照者均未發(fā)現(xiàn)相同突變，綜合以上分析考慮該突變?yōu)橹虏⌒酝蛔?。而剪切突變?dǎo)致的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域的受損，也許是患者病情較重且迅速進(jìn)展的原因之一。

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