吳 倫，蘇 陽，范海潮，劉 杰，田振坤

(1. 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 中醫(yī)藥研究院，哈爾濱150040；2. 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，哈爾濱150040；3. 宜康(杭州)生物技術(shù)有限公司，杭州 310011)

RP-HPLC法測定北五味子中6種木脂素類成分

吳 倫1，蘇 陽2，范海潮3，劉 杰1，田振坤1

(1. 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 中醫(yī)藥研究院，哈爾濱150040；2. 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，哈爾濱150040；3. 宜康(杭州)生物技術(shù)有限公司，杭州 310011)

采用RP-HPLC法同時(shí)測定北五味子中6種木脂素類成分.色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18(5 μm，4.6×150 mm)，流動(dòng)相為甲醇-水溶液梯度洗脫，檢測波長為254 nm，柱溫為25 ℃.結(jié)果表明：五味子甲素在40.4～600.0 μg/mL(r=0.999 8)、五味子乙素在42.0～420.0 μg/mL(r=0.999 9)、五味子丙素在15.8～118.8 μg/mL(r=0.999 5)、五味子醇甲在10.0～160.0 μg/mL(r=0.999 9)、五味子醇乙在15.5～388.0 μg/mL(r=0.999 5)、五味子酯甲在16.3～408.0 μg/mL(r=0.999 9)范圍內(nèi)峰面積與對照品質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系(n=6).6種成分的加樣回收率均高于98%，RSD值小于3%本方法簡便，準(zhǔn)確，快速，重現(xiàn)性好，可用于北五味子中有效成分的定量分析.

北五味子；木脂素；高效液相色譜法；含量測定

北五味子系木蘭科植物五味子的成熟干燥果實(shí)，具有益氣生津、收斂固澀、補(bǔ)腎寧心之功效，臨床上常用于津傷口渴、久嗽虛喘及心悸失眠等癥[1-2].自然分布黑龍江省小興安嶺、完達(dá)山、張廣才嶺、老爺嶺等山區(qū)，清河林區(qū)位于小興安嶺南麓，松花江中游北岸，地理位置得天獨(dú)厚，為五味子種植提供了良好生長環(huán)境.為了更好地控制與鑒別北五味子質(zhì)量，以產(chǎn)自清河林區(qū)北五味子為研究對象，研究北五味子中木脂素類化學(xué)成分，該方法排除了樣品中雜質(zhì)成分的干擾，能夠較好地對指標(biāo)組分進(jìn)行準(zhǔn)確定量.本文針對北五味子中六種木脂素成分進(jìn)行含量測定，為北五味子藥材的質(zhì)量控制與開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù).

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀(四元泵G1311C、紫外檢測器G1314B)，Agilent公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(東京理化器械株式會(huì)社)；MS205DU型電子天平(梅特勒-托利多上海有限公司).五味子藥材(清河林業(yè)局育林林場)；五味子醇乙、五味子醇甲、五味子乙素、五味子酯甲、五味子甲素、五味子丙素(中國食品藥品檢定研究院)；甲醇色譜純(Dik-ma公司)；甲醇(西隴化工股份有限公司)；其他試劑均為分析純.

1.2 供試品溶液制備

稱取藥材適量，粉碎，過60目篩，于60 ℃下干燥至恒重.精密稱取干燥的五味子粉末2.01 g，加入85%乙醇40 mL回流提取3次，3 h/次，過濾，減壓干燥后加甲醇定容至25mL容量瓶中，得供試品溶液.

1.3 對照品溶液制備

分別精密稱取6種對照品適量，分別用甲醇定容置25 mL容量瓶中，制得質(zhì)量濃度分別為200、1 552、

1 632、4 040、4 200、1 584 μg/mL的對照品溶液.

1.4 液相色譜條件[3-4]

比較多種洗脫梯度，確定最佳色譜條件是色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18(5 μm，4.6×150 mm).流動(dòng)相：A：水、B：甲醇，梯度洗脫：0～20 min 50%B→55%B；20～30 min 55%B→58%B；30～60 min 58%B→70%B；60～80 min 70%B→79%B；80～90 min 79%B→83%B；90～100 min 83%B→100%B；流速：1.0 mL/min；柱溫：25 ℃；檢測波長：254 nm；進(jìn)樣量：20 μL.洗脫梯度出峰數(shù)目多，且峰形對稱、分離度好.

圖1 北五味子對照品HPLC色譜圖

圖2 北五味子HPLC色譜圖

2 方法學(xué)驗(yàn)證

2.1 線性關(guān)系考察

分別精密量取6種對照品儲(chǔ)備液，置于10 mL容量瓶中用甲醇定容至刻度[5-8].體積和對照品質(zhì)量濃度見表1，按“1.4項(xiàng)下”色譜條件測定，分別進(jìn)樣20 μL，記錄色譜峰面積.以北五味子各對照品質(zhì)量濃度C(μg/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積S值為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表2.

表1 各對照品體積、質(zhì)量濃度和峰面積值

對照品123456五味子醇甲體積/mL0．51．02．04．06．08．0質(zhì)量濃度/(μg·mL-1)10．020．040．080．0120．0160．0峰面積3196651290256139315194五味子醇乙體積/mL0．10．41．01．51．82．5質(zhì)量濃度/(μg·mL-1)15．562．1155．2232．8279．4388．0峰面積2389002081313137265423五味子酯甲體積/mL0．10．250．51．01．52．5質(zhì)量濃度/(μg·mL-1)16．340．881．6163．2244．8408．0峰面積3597991638318547547800

續(xù)表

對照品123456五味子甲素體積/mL0．10．20．30．41．01．5質(zhì)量濃度/(μg·mL-1)40．480．8121．2161．6404．0600．0峰面積11892506349247951292219177五味子乙素體積/mL0．10．140．20．30．41．0質(zhì)量濃度/(μg·mL-1)42．058．884．0126．0168．0420．0峰面積1044168523093467465411864五味子丙素體積/mL0．10．250．350．450．50．75質(zhì)量濃度/(μg·mL-1)15．839．655．471．379．2118．8峰面積3239261426184721323185

表2 北五味子木脂素線性回歸方程

對照品方程R范圍/(μg·mL-1)五味子醇甲Y=32．531X-4．74930．999910．0～160．0五味子醇乙Y=13．705X-4．71250．999215．5～388．0五味子酯甲Y=19．041X+59．4940．999916．3～408．0五味子甲素Y=32．39X-254．050．999840．4～600．0五味子乙素Y=28．43X-88．2990．999942．0～420．0五味子丙素Y=28．1X-140．320．999515．8～118．8

2.2 精密度實(shí)驗(yàn)

分別取6種對照品溶液各0.5 mL，置于10 mL容量瓶中用甲醇稀釋至刻度.按“1.4項(xiàng)下”色譜條件進(jìn)樣20 μL連續(xù)進(jìn)樣六次，記錄6種木脂素對照品峰面積，五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素的RSD分別為0.4%、0.5%、0.3%、0.5%、0.6%、0.9%，表明儀器精密度良好.

2.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

分別取6種對照品溶液各0.5 mL，置于10 mL容量瓶中用甲醇稀釋至刻度.分別于0、1、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣20 μL，記錄峰面積.五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素的RSD分別為0.3%、0.3%、0.6%、0.5%、0.4%、0.7%，表明供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好.

2.4 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

取同批次藥材粉末6份，照“1.2項(xiàng)下”方法平行制備樣品溶液并依法測定，結(jié)果：五味子醇甲R(shí)SD為0.8%、五味子醇乙RSD為0.5%、五味子酯甲R(shí)SD為0.9%、五味子甲素RSD為0.6%、五味子乙素RSD為0.7%、五味子丙素的RSD為0.8%，表明該方法的重現(xiàn)性良好.

2.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

精密稱取上述已知質(zhì)量分?jǐn)?shù)同批次藥材兩份，分別加入6種對照品溶液適量按“1.2項(xiàng)下”方法配制十份，在“1.4項(xiàng)下”色譜條件下進(jìn)樣20 μL，計(jì)算各組分回收率.結(jié)果：五味子醇甲平均回收率98.7%(RSD為1.8%)、五味子醇乙平均回收率101.4%(RSD為1.3%)、五味子酯甲平均回收率99.7%(RSD為2.1%)、五味子甲素平均回收率98.3%(RSD為1.7%)、五味子乙素平均回收率102.5%(RSD為1.6%)、五味子丙素平均回收率103.1%(RSD為2.2%).結(jié)果表明，該處理方法對6種對照品具有較高的回收率.

2.6 百分含量測定

取同一產(chǎn)區(qū)5批北五味子藥材，按照“1.2項(xiàng)下”方法制備供試品溶液，在“1.4項(xiàng)下”色譜條件進(jìn)樣20 μL測定3次，記錄6種木脂素對照品色譜峰面積，計(jì)算各組分百分含量，結(jié)果見表3.

表3 同一產(chǎn)區(qū)5批北五味子各木脂素百分含量變化(%)

樣品五味子醇甲五味子醇乙五味子酯甲五味子甲素五味子乙素五味子丙素總木脂素10．80430．38940．13020．17220．31560．03931．851020．81010．35740．09550．15300．33740．05101．804430．78770．38000．12140．14770．30000．04951．789940．77100．48920．09550．15270．44100．07952．028550．85370．44830．09360．24270．47790．13172．1575

3 結(jié) 語

東北道地藥材北五味子作為臨床常用中藥，主要來源于野生資源，由于森林面積的減少及五味子果實(shí)的掠奪性開采，致使北五味子的產(chǎn)量逐年減少，現(xiàn)今采用人工大面積種植北五味子，但質(zhì)量不均影響北五味子的開發(fā)利用，因此建立簡便有效的質(zhì)量控制方法必不可少.

本實(shí)驗(yàn)建立了RP-HPLC測定北五味子中6種木脂素含量測定方法.該法具有快速、準(zhǔn)確、靈敏度高、重現(xiàn)性好等特點(diǎn)，可用于北五味子中有效成分的定量分析，為北五味子的開發(fā)利用提供依據(jù).運(yùn)用該方法對清河林區(qū)北五味子中五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素和五味子酯甲含量進(jìn)行了測定，結(jié)果表明該地區(qū)北五味子中6種木脂素類成分含量較高，證實(shí)清河林區(qū)為北五味子種植提供了良好的生長環(huán)境.

[1] 國家藥典委員會(huì). 中國藥典(一部)[M]. 北京: 中國醫(yī)藥科技出版社, 2010. 61-62.

[2] 楊慧杰, 楊世海. 五味子藥理作用研究概況[J]. 人參研究, 1999, 11(4): 5-8.

[3] 付紹平, 楊 博, 陳 彤, 等. 北五味子的液相色譜指紋圖譜的建立[J]. 色譜, 2008, 26(1): 64-67.

[4] 王金鳳, 于源華, 蔡林君, 等. 不同產(chǎn)地五味子HPLC指紋圖譜分析[J]. 長春理工大學(xué)學(xué)報(bào), 2006, 29(3): 69-71.

[5] 楊春娟, 熊志立, 等. RP-HPLC法同時(shí)測定北五味子中五味子甲素與五味子乙素含量[J]. 沈陽藥科大學(xué)學(xué)報(bào), 2006, 23(10):660-671.

[6] 胡俊揚(yáng), 陸兔林, 毛春芹, 等. HPLC法同時(shí)測定五味子飲片中6個(gè)木脂素類成分的含量[J]. 藥物分析雜志, 2011, 31(12): 2225-2228.

[7] 張延妮, 岳宣峰, 王喆之. 反相高效液相色譜同時(shí)測定五味子中五味子醇甲、五味子醋甲和五味子乙素的含量[J]. 分析科學(xué)學(xué)報(bào), 20

[8] 吳 倫，高 翔，田振坤.北五味子中三萜總皂苷提取工藝優(yōu)化[J]. 哈爾濱商業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2015，31(4)：398-400.

Simultaneous determination of content of 6 kinds of lignans in Fructus schisandrae chinensis by RP-HPLC

WU Lun1, SU Yang2, FAN Hai-chao3, LIU Jie1, TIAN Zhen-kun1

(1. Research Institute of Traditional Chinese Medicine， Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin 150040, China; 2. School of Pharmacy, Heilongjiang University of Chinese Medicine,Harbin 150040, China; 3. Abcam (Hangzhou)Biotechnology Co., Ltd, Hangzhou 310011, China)

In this paper, RP-HPLC to simultaneously determine 6 kinds of lignans in fructus schisandrae chinensis was adopted. The column was Agilent ZORBAX SB-C18(5 μm, 4.6×150 mm). The mobile phase was consisted of methanol-water solution(gradient elution). The detect wavelength was set at 254 nm, and the column temperature was 25 ℃. Results indicated that deoxyschizandrin at the range of 40.4～600.0 μg/mL (r=0.999 8),γ-Schisandrin at the range of 42.0～420.0 μg/mL (r=0.999 9), Schisandrin C at the range of 15.8～118.8 μg/mL (r=0.999 5), Schisandrin at the range of 10.0～160.0 μg/mL (r=0.999 9), Schisandrol at the range of 15.5～388.0 μg/mL (r=0.999 5) Schisantherin A at the range of 16.3～408.0 μg/mL (r=0.999 9) have good linear relationship between peak area and concentration of

ubstance (n=6). The sample recovery rate of 6 kinds of ingredients was higher than 98%, and theRSDvalue was less than 3%. This method was simple, accurate, celerity and good reproducibility, and can be used for quantitative analysis of effective ingredients of fructus schisandrae chinensis.

fructus schisandrae chinensis; lignans; RP-HPLC; content determination

2014-07-17.

吳 倫(1983-)，男，博士，助理研究員，研究方向：中藥創(chuàng)新藥物研究

田振坤(1955-)，男，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：中藥創(chuàng)新藥物研究.

R284

A

1672-0946(2015)05-0536-04