高 蕊，王 鑫，宋志鵬，蘇 楊，于 淼，楊志偉，林 平

(哈爾濱商業(yè)大學(xué) 食品工程學(xué)院 省高校食品科學(xué)與工程重點實驗室，哈爾濱 150076)

溶劑沉降法純化豬軟骨中硫酸軟骨素

高 蕊，王 鑫，宋志鵬，蘇 楊，于 淼，楊志偉，林 平

(哈爾濱商業(yè)大學(xué) 食品工程學(xué)院 省高校食品科學(xué)與工程重點實驗室，哈爾濱 150076)

采用豬軟骨為原料，以硫酸軟骨素得率為指標(biāo)，對有機溶劑純化硫酸軟骨素的方法進行研究.以乙醇為溶劑，選擇硫酸軟骨素提取液和乙醇體積比，乙醇體積分數(shù)，氯化鈉質(zhì)量濃度，pH值，醇沉次數(shù)為影響因素純化硫酸軟骨素，采用正交實驗確定最佳純化工藝條件.實驗結(jié)果表明，硫酸軟骨素最佳純化條件為：提取液和乙醇體積比為1∶25，乙醇體積分數(shù)為80%，NaCl質(zhì)量濃度為30 g/L，pH值為6.4，醇沉次數(shù)為3次，硫酸軟骨素得率為56.76%.

硫酸軟骨素;乙醇沉降法;純化;軟骨

硫酸軟骨素(chondroitin sulfate, CS)，別名?；擒浌撬睾涂档脤幍?，是共價連接在蛋白質(zhì)上形成蛋白聚糖的一種廣泛存在于動物結(jié)締組織中的酸性粘多糖[1-2]，其糖鏈由交替的D-葡萄糖醛酸以β-1，3糖苷鍵與N-乙酰半乳糖胺(又稱N-乙酰-D-氨基半乳糖)鏈接形成二糖，而二糖單位之間則是通過一個似糖鏈街區(qū)連接到核心蛋白的絲氨酸殘基上，以β-1，4糖苷鍵連接而成[3-4].干燥軟骨中含有約20%～40%的CS，且因提取于不同年齡、種類、部位以及疾病等的動物軟骨而有不同的種類和含量[5].CS 是一種白色或略帶黃色的粉末狀物質(zhì)，無臭、無味，因有羧基、羥基、硫酸基等極性基團存在其分子結(jié)構(gòu)中而擁有比較強的吸濕性、易溶于水，且水溶液具有黏稠性，加熱不凝結(jié)，溫度超過60 ℃則會發(fā)生降解；CS不溶于甲醇、乙醇、丙酮、乙醚和冰醋酸等有機溶劑，系一種生化產(chǎn)品，迄今為止尚無法人工合成[6].但目前尚存在純化工藝復(fù)雜、費時、成本高、產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定、得率低等問題[7-8].因此，優(yōu)化硫酸軟骨素純化工藝提高產(chǎn)品得率和純度，提高畜禽產(chǎn)業(yè)的附加值，迫在眉睫.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

豬月牙骨，市售；硫酸軟骨素粗提物，實驗室自制

1.2 主要試劑與儀器

咔唑(上海源葉生物科技有限公司)無水乙醇(哈爾濱市宏利達盛有限公司)；氫氧化鈉(沈陽盛金隆有限公司)；鹽酸(北京俱時化工)；氯化鈉(山東恒天化工)；濃硫酸(哈爾濱市化工試劑廠)；FZ102機型微型植物粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司)；TU-1900 型雙光束紫外分光光度計(普析通用儀器有限責(zé)任公司)；TDL80-2B型低速臺式離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠)；恒溫水浴振蕩器(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；DK-98-1型電子恒溫水浴箱(天津市泰斯特儀器有限公司)；ALC-1100.2型電子分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；便攜式pHS-3C型數(shù)字精密pH計(中國上海儀器廠).

1.3 實驗方法

1.3.1豬軟骨中CS提取

稱取一定質(zhì)量的豬軟骨，平均等份置于250 mL燒杯中，按照豬軟骨和2.5%NaOH溶液1∶6比例添加，計算溶液濃度，用NaCl溶液調(diào)至濃度達2.5 mol/L，并使溶液pH值達到12～13，在水浴溫度為35 ℃中振蕩24 h保留上清液備用.調(diào)節(jié)上清液pH值為7～8，迅速升溫至80～90 ℃，保持20 min后冷卻過濾，得到鹽解液.調(diào)節(jié)鹽解液pH值為2～3，攪拌10 min后靜置.調(diào)節(jié)過濾后上清液pH值至6.5，加去離子水使溶液的NaCl濃度達到1 mol/L.上述備用溶液加入無水乙醇(95%)，使乙醇的體積分數(shù)達到50%～60%，采用無水乙醇洗滌沉淀3～4次，真空干燥后即得CS粗品[9].

1.3.2最大吸收波長的確定

配制質(zhì)量濃度為0.125 g/ L 的CS標(biāo)準(zhǔn)品溶液，取1mL于冰水浴中冷卻后加入6.00 mL濃硫酸，振蕩均勻后于100 ℃中加熱20 min，迅速冷卻后加入0.20 mL質(zhì)量濃度為1.00 g/L 的咔唑溶液，,搖勻后置于100 ℃中加熱15 min，顯色，迅速冷卻至室溫[10].采用無醛乙醇作為空白溶液，雙光束紫外分光光度計在波長于400～600 nm范圍內(nèi)進行掃描，確定CS最大吸收波長.

1.3.3硫酸軟骨素純化的單因素試驗

1)提取液和乙醇體積比的選擇

取5個燒杯，分別吸取硫酸軟骨素粗提物溶液(0.3 g硫酸軟骨素粗提物和1 mL蒸餾水)，分別加入30 g/L的NaCl，調(diào)節(jié)pH值至6.4，加入體積分別為5、10、15、20、25 mL的75%的乙醇，靜置1 h后，500 r/min離心5 min，棄去上清液后沉淀用少量無水乙醇洗滌脫水，于 60 ℃真空干燥箱中干燥，計算CS得率，確定提取液和乙醇的最佳體積比.

2)純化溶劑乙醇體積分數(shù)的選擇

取5個燒杯，分別吸取硫酸軟骨素粗提物溶液(0.3 g硫酸軟骨素粗提物和1 mL蒸餾水)，分別加入30 g/L的NaCl，調(diào)節(jié) pH值至6.4，加入20 mL體積分數(shù)分別為 60、65、70、75、80%的乙醇，靜置1 h后，500 r/min離心5 min，棄去上清液后沉淀用少量無水乙醇洗滌脫水，于 60 ℃真空干燥箱中干燥，計算CS得率，確定純化CS的最佳乙醇體積分數(shù).

3、)純化溶劑NaCl質(zhì)量濃度的選擇

取5個燒杯，分別吸取硫酸軟骨素粗提物溶液(0.3 g硫酸軟骨素粗提物和1 mL蒸餾水)，分別加入10、20、30、40、50 g/L的NaCl，調(diào)節(jié) pH值至6.4，分別加入20 mL 體積分數(shù)為75%的乙醇，靜置1 h后，500 r/min離心5 min，棄去上清液后沉淀用少量無水乙醇洗滌脫水，于 60 ℃真空干燥箱中干燥，計算CS得率，確定純化CS的最佳NaCl質(zhì)量濃度.

4)pH值的選擇

取5個燒杯，分別吸取硫酸軟骨素粗提物溶液(0.3g硫酸軟骨素粗提物和1mL蒸餾水)，分別加入30 g/L的NaCl，調(diào)節(jié)pH值分別為6.1、6.2、6.3、6.4、6.5，分別加入20 mL 體積分數(shù)為75%的乙醇溶液，靜置1 h后，500 r/min離心5 min，棄去上清液后沉淀用少量無水乙醇洗滌脫水，于 60 ℃真空干燥箱中干燥，計算CS得率，確定純化CS最佳pH值.

5)醇沉次數(shù)的選擇

取5個燒杯，分別吸取硫酸軟骨素粗提物溶液(0.3 g硫酸軟骨素粗提物和1 mL蒸餾水)，分別加入30 g/L的NaCl，調(diào)節(jié)pH至6.4，分別加入75%的乙醇20 mL，分別醇沉1、2、3、4、5次，靜置1 h后，500 r/min離心5 min，棄去上清液后沉淀用少量無水乙醇洗滌脫水，于60 ℃真空干燥箱中干燥，計算CS得率，確定純化最佳醇沉次數(shù).

1.3.4正交試驗法優(yōu)化CS純化的工藝條件

根據(jù)單因素實驗的結(jié)果，選擇影響純化效果的四個主要因素：提取液與乙醇體積比(A)、乙醇體積分數(shù)(B)、NaCl質(zhì)量濃度(C)，醇沉次數(shù)(D)采用正交設(shè)計表L9(34)安排實驗.見表1.

表1 CS純化因素與水平表

1.3.5驗證實驗

將CS粗提取物按有機溶劑法純化后的最佳條件進行三次平行試驗，沉淀物干燥后稱量，計算出硫酸軟骨素得率.

1.3.6CS的定性實驗

將CS提取物采用硫酸-咔唑法顯色后，在400～600 nm范圍內(nèi)掃描，比較豬軟骨中CS提取物與CS標(biāo)準(zhǔn)品圖譜的出峰位置及峰形，對所提物質(zhì)進行定性實驗.

2 結(jié)果與討論

2.1 最大吸收波長確定結(jié)果與分析

由圖1可以看出，CS標(biāo)準(zhǔn)品溶液在526 nm有最大吸收峰，因此選擇526 nm為CS最大吸收波長.

圖1 CS標(biāo)準(zhǔn)品掃描圖譜

2.2 溶劑沉降法純化CS的單因素試驗結(jié)果與分析

選取影響有機溶劑法純化CS的主要因素：提取液和乙醇體積比，乙醇體積分數(shù)，氯化鈉質(zhì)量濃度，pH值及醇沉次數(shù)分別進行單因素實驗，以CS得率為指標(biāo)，確定影響有機溶劑法純化CS的主要因素，為正交實驗提供依據(jù).

2.2.1提取液和乙醇體積比對純化效果的影響

如圖2所示，當(dāng)粗提取液與乙醇體積比從1∶5至1∶20時，CS得率明顯增加；當(dāng)提取液與乙醇體積比為1∶20時，CS得率最高；當(dāng)提取液與乙醇體積比大于1∶20時，CS得率呈下降趨勢.因此體積比的最佳比例為1∶20.

圖2 體積比對純化效果的影響

2.2.2乙醇體積分數(shù)對純化效果的影響

如圖3所示，乙醇體積分數(shù)在60%～70%時，CS得率有所增加；乙醇體積分數(shù)在70%～75%時，CS得率趨于平穩(wěn)；乙醇體積分數(shù)為75%時，CS得率最高；當(dāng)乙醇體積分數(shù)大于75%時，由于乙醇體積分數(shù)升高導(dǎo)致CS得率下降.乙醇沉淀CS的原理在于加入乙醇后的CS水溶液介電常數(shù)降低，破壞了CS分子表面溶劑化水膜，導(dǎo)致帶電基團之間的作用力增加，分子間相互聚集，使CS沉淀.隨溶劑體積分數(shù)的增加，沉淀物中CS質(zhì)量和純度也隨之增大，當(dāng)乙醇體積分數(shù)繼續(xù)增大時，物質(zhì)本身其他雜質(zhì)成分(如蛋白等)也隨之沉淀.因此乙醇的最佳體積分數(shù)為75%.

圖3 乙醇體積分數(shù)對純化效果的影響

2.2.3氯化鈉質(zhì)量濃度對純化效果的影響

如圖4所示，NaCl質(zhì)量濃度在10～30 g/L時，CS得率明顯上升；當(dāng)NaCl質(zhì)量濃度在30 g/L時，CS得率取得最大值；當(dāng)NaCl質(zhì)量濃度大于30 g/L時，CS得率明顯下降.由于CS與水溶液之間具有強烈的吸附作用，為使CS沉淀，必須破壞水溶液在膠體微粒之間形成的高分子水化層.NaCl對純化效果的影響包括NaCl 與CS爭奪水分子和NaCl 使水分子極化而定向排列兩方面.減弱CS與水溶液的結(jié)合力使其失去水化層，導(dǎo)致溶解度降低；另一方面定向排列導(dǎo)致水的活度降低而減弱其與CS的水合作用.但避免溶液中其他雜質(zhì)的溶出，選擇NaCl的最佳質(zhì)量濃度為30 g/L.

圖4 氯化鈉質(zhì)量濃度對純化效果的影響

2.2.4pH值對純化效果的影響

如圖5所示，當(dāng)pH值從6.1～6.3時，CS得率明顯上升；當(dāng)pH值在6.3～6.4時，CS得率趨于平穩(wěn)；當(dāng)pH值6.4時，CS得率最高；當(dāng)pH值大于6.4時，CS得率呈下降趨勢.CS屬于兩性化合物，pH值的變化會影響在醇沉體系中的溶解度，凈電荷數(shù)少時，分子間吸引力增加，相互凝聚而產(chǎn)生沉淀也隨之增加.因此最佳pH值為6.4.

圖5 pH值對純化效果的影響

2.2.5醇沉次數(shù)對純化效果的影響

如表2所示，醇沉次數(shù)小于4次時，純化物中CS含量隨醇沉次數(shù)增多而增加；當(dāng)醇沉次數(shù)為4次時，CS得率為最大；當(dāng)醇沉次數(shù)大于4次時，CS得率下降.CS含量隨醇沉次數(shù)增加而增加，由于豬軟骨中粗提物中蛋白質(zhì)、氨基酸等雜質(zhì)會隨著醇沉次數(shù)的增多而逐漸減少，豬軟骨CS純化物中的葡萄糖醛酸含量隨之增加，但CS的得率降低.因此選擇最佳醇沉次數(shù)為4次.

表2 豬軟骨CS醇沉次數(shù)對純化效果的影響

2.3 正交試驗法優(yōu)化硫酸軟骨素純化的工藝條件結(jié)果與分析

通過正交試驗確定最佳的純化工藝，為了使實驗數(shù)據(jù)更加準(zhǔn)確，每組實驗均做3次的平行實驗，考察指標(biāo)為CS得率，其實驗結(jié)果見表3.

表3 溶劑沉降法純化CS正交試驗結(jié)果表

由表4的極差分析可知，各因素對CS 得率影響的大小順序為A > C > D > B，即CS提取液與乙醇體積>NaCl質(zhì)量濃度>醇沉次數(shù)>乙醇體積分數(shù).最佳的因素水平組合為A3B2C3D1.即體積比1∶25，乙醇體積分數(shù)75%，NaCl質(zhì)量濃度40 g/L，醇沉次數(shù)3次.

表4 正交試驗方差分析表

2.4 驗證實驗結(jié)果與分析

由表5所示，經(jīng)3次平行實驗，計算CS得率為53.03%.但是正交設(shè)計試驗中第9組的CS得率為56.76%，大于正交試驗法優(yōu)化的CS得率53.03%，因此對驗證實驗結(jié)果進行顯著性分析.經(jīng)t檢驗顯著性分析后得知，第9組實驗和正交試驗法優(yōu)化后的實驗得率之間顯著性(P<0.05)，選擇第9組，即純化的最佳條件為提取液與乙醇體積比為1∶25，乙醇體積分數(shù)為80%，氯化鈉質(zhì)量濃度為30 g/L，醇沉次數(shù)為3次，硫酸軟骨素得率為56.76%.

表5 驗證實驗結(jié)果分析表

2.5 定性試驗結(jié)果與分析

由圖6可見，CS準(zhǔn)品在最大吸收波長526 nm處有較穩(wěn)定的吸收峰，以此確定豬軟骨中CS的最大吸收波長為526 nm.從豬軟骨中提取的CS純化后的樣品與CS標(biāo)品的出峰位置及峰形一致，因此確定純化物為硫酸軟骨素.

圖6 硫酸軟骨素標(biāo)品與樣品紫外掃描圖譜

3 結(jié) 語

采用市售豬軟骨為原料，以CS純化后得率為指標(biāo)，對溶劑沉降法進行研究，以乙醇為主要溶劑，選擇硫酸軟骨素粗提取物溶液體積和乙醇體積比，

醇沉體系的乙醇體積分數(shù)，NaCl質(zhì)量濃度，pH值，重復(fù)沉淀次數(shù)為影響因素純化硫酸軟骨素，得出以下結(jié)論：硫酸軟骨素的最佳純化工藝條件為：硫酸軟骨素粗提取物溶液體積和乙醇體積比為1∶25，醇沉體系的乙醇體積分數(shù)為80%，NaCl質(zhì)量濃度為30 g/L，重復(fù)沉淀3次，通過紫外光譜分析，證明豬軟骨CS純化后的物質(zhì)與CS標(biāo)準(zhǔn)品峰形位置一致，證明從豬軟骨中純化后的物質(zhì)是CS，純化得率為56.76%.

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Purification of chondroitin sulfate by solvent sedimentation from pig cartilage

GAO Rui, WANG Xin, SONG Zhi-peng, SU Yang, YU Miao, YANG Zhi-wei, LIN Ping

(Key Laboratory of Food Science and Engineering, School of Food Engineering, Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China)

Chondroitin sulfate from pig cartilage were extracted and purified with the method of solvent sedimentation by the orthogonal experiment. Five independent variables (the volume ratio of the crude chondroitin sulfate and ethanol, the ethanol concentration, the sodium chloride concentration, pH and the number of times of ethanol sedimentary) were explored. The result showed that the optimum purification conditions were as follows: the volume ratio of the crude chondroitin sulfate and ethanol, the ethanol concentration, the sodium chloride concentration, pH and the number of times of ethanol sedimentary were 1∶25, 80%, 30 g/L, 6.4 and 3, respectively. The yield of Chondroitin sulfate was up to 56.76%.

chondroitin sulfate; ethanol sedimentation; purification; cartilage

2014-09-02.

大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目(201410240103)

高 蕊(1993-)，女，研究方向：食品營養(yǎng)與安全.

王 鑫(1984-)，女，博士，講師，研究方向：食品營養(yǎng)與安全，農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏.

S2

A

1672-0946(2015)05-0593-05