鄒 翔，盛潔靜，曲中原，張振國，徐 陽，季宇彬

(1. 哈爾濱商業(yè)大學(xué) 藥物研究所博士后科研工作站，哈爾濱 150076；2. 哈爾濱商業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，哈爾濱 150076；3. 哈爾濱商業(yè)大學(xué) 英才學(xué)院，哈爾濱 150028)

曇花中槲皮素、異鼠李素和山奈酚量的測定

鄒 翔1，盛潔靜2，曲中原2，張振國3，徐 陽3，季宇彬1

(1. 哈爾濱商業(yè)大學(xué) 藥物研究所博士后科研工作站，哈爾濱 150076；2. 哈爾濱商業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，哈爾濱 150076；3. 哈爾濱商業(yè)大學(xué) 英才學(xué)院，哈爾濱 150028)

建立高效液相法同時(shí)測定曇花中含槲皮素、山奈酚和異鼠李素的量.運(yùn)用Diamonsil C18色譜柱為分析柱，以甲醇-0.4%磷酸水溶液(55∶45)為流動相，流速為1.0 mL/min，檢測波長為360 nm.測得槲皮素在5.5～88 μg/mL范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，r=0.999 9(n=6)；山奈酚在4～64 μg/mL范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，r=0.999 9(n=6)；異鼠李素在6.5～104 μg/mL范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，r=0.999 9(n=6)，三者的回收率分別為(99.84±0.23)%(RSD=0.24%)、(100.20±0.52)%(RSD=0.38%)、(99.99±0.12)%(RSD=0.11%).槲皮素、異鼠李素和山奈酚的量分別為0.05、0.026、0.039 mg/g.本方法可同時(shí)測定曇花中槲皮素、異鼠李素和山奈酚，操作簡單、靈敏、重復(fù)性好，適用于曇花及其制劑的質(zhì)量控制.

曇花；槲皮素；山奈酚；異鼠李素；高效液相色譜法

曇花[Epiphyllum oxypetalum (DC.)Haw]為仙人掌科曇花屬多年生常綠肉質(zhì)植物，除了具有較強(qiáng)的觀賞性外，作為日用品和化妝品添加劑方面有所應(yīng)用[1].據(jù)《中華本草》記載，曇花出自《陸川本草》，其花和莖均可入藥，具有清肺止咳、涼血止血、養(yǎng)心安神之功效，臨床上多用于治療肺熱咳嗽、肺癆、咳血、崩漏、心悸、失眠等[2].含有豐富的Fe、Zn、Mn和Cu等微量元素，具有一定的藥用和食用價(jià)值[3].曇花主要成分為黃酮類化合物，其中苷元以槲皮素、異鼠李素和山奈酚為主[4].槲皮素、異鼠李素和山奈酚均有止咳、祛痰、平喘的藥理作用，與曇花的功效作用相符[5-7].目前，尚未見關(guān)于曇花質(zhì)量控制研究的相關(guān)報(bào)道.本文采用高效液相色譜法測定曇花中含黃酮類成分槲皮素、異鼠李素和山奈酚的量，為曇花藥材的質(zhì)量評價(jià)及曇花藥用資源的開發(fā)和利用奠定基礎(chǔ).

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1200系列高效液相色譜儀(江蘇舜星科技有限公司)；Diamonsil C18色譜柱(5 μm 200×4.6 mm)；JM型電子天平(余姚市紀(jì)銘稱重校驗(yàn)設(shè)備有限公司)；FW100型高速萬能粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司)；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇省常州市恒久儀器制造有限公司)；BSA124S分析天平[賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司]；KQ5200DB型數(shù)顯超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；SB-2000型水浴鍋(上海愛朗儀器有限公司)；SHB-111型循環(huán)水式多用真空泵(鄭州世紀(jì)雙科實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；DK-98-11型電熱恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司)；DHG-9023型電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；N-1000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛朗儀器有限公司)；LD4-2A型低速離心機(jī)(北京京立離心機(jī)有限公司).

1.2 試劑

甲醇(色譜純)、鹽酸(色譜純)、乙醇(分析純)、磷酸(揚(yáng)州滬寶化學(xué)試劑有限公司)，娃哈哈純凈水(天津娃哈哈集團(tuán)有限公司).

1.3 藥材、標(biāo)準(zhǔn)品

曇花為仙人掌科植物曇花(Epiphyllumoxypetalum(DC.)Haw)的干燥花(購自安徽亳州本草藥業(yè)，經(jīng)哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院張德連教授鑒定).槲皮素對照品(批號 AB131Q-a)、山奈酚對照品(批號 AB395K)、異鼠李素對照品(批號 AB1251)，均購自天津一方科技有限公司.

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Diamonsil C18色譜柱為分析柱(200 mm×4.6 mm, 5 μm)，填充劑為十八烷基硅烷鍵合硅膠，流動相為甲醇-0.4%磷酸水溶液(55∶45)，流速為1.0 mL/min，檢測波長為360 nm，柱溫為室溫；進(jìn)樣量為10 μL.

2.2 溶液的制備

2.2.1對照品溶液制備

精密稱取槲皮素、異鼠李素、山奈酚對照品分別為5.5、6.5、4.0 mg，置于50 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，即得槲皮素0.11 mg/mL，異鼠李素0.13 mg/mL，山奈酚0.08 mg/mL液的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶，4 ℃保存，備用.

2.2.2供試品溶液制備

稱取曇花粉末20g置于圓底燒瓶中，80%乙醇400 mL，80 ℃熱回流提取2次，4 h/次，提取液過濾、濃縮、定容至100 mL[8].過濾后取續(xù)濾液60 mL，濃縮后用甲醇定容至10 mL.取4 mL上述溶液，加甲醇溶液4 mL和25%鹽酸溶液2 mL于具塞試管中進(jìn)行酸化處理，將試管置于95 ℃水浴加熱4 h，中途攪拌30 min，在冰水中速冷后轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶，甲醇補(bǔ)足體積，搖勻，0.45 μm濾膜濾過，得供試品溶液[9-10].

2.3 線性關(guān)系考察

精密吸取混合對照品溶液0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mL分別置10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，即得系列對照品溶液.上述標(biāo)準(zhǔn)溶液分別進(jìn)樣10 μL，測定吸收峰面積.按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析并記錄峰面積.以質(zhì)量濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程分別為槲皮素Y= 41 937X-44.997，r=0.999 9；山奈酚Y= 36 989X-54.253，r=0.999 9；異鼠李素Y= 64 930X-55.293，r=0.999 9.結(jié)果表明槲皮素、山奈酚、異鼠李素質(zhì)量濃度分別在5.5～88、4～64、6.5～104 μg/mL內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系.

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1精密度實(shí)驗(yàn)

按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，精密吸取曇花提取溶液10 μL，同時(shí)測定槲皮素、山奈酚和異鼠李素的色譜峰峰面積，連續(xù)測定6次，RSD值分別為1.2%、1.6%、1.2%(n=6)，表明儀器精密度良好.

2.4.2穩(wěn)定性試驗(yàn)

按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，取曇花提取溶液，分別于0、2、4、6、8、10 h進(jìn)樣10 μL，同時(shí)測定槲皮素、山奈酚和異鼠李素的色譜峰峰面積，RSD值分別為0.3%、0.5%、0.6%(n=6)，表明對照品溶液在10 h內(nèi)基本穩(wěn)定.

2.4.3重復(fù)性試驗(yàn)

按“2.2”項(xiàng)方法取曇花粉末6份，按上述熱回流提取方法平行制備，取曇花提取溶液，分別進(jìn)樣10 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，同時(shí)測定槲皮素、山奈酚和異鼠李素色譜峰峰面積，RSD值分別為1.0%、1.4%、1.1%(n=6)，表明該方法重復(fù)性良好.

2.4.4回收率試驗(yàn)

精密量取曇花粉末50 g(含有0.005%槲皮素、0.002 6%山奈酚和、0.003 9%鼠李素和0.011 4%總黃酮)，按“2.2”項(xiàng)下進(jìn)行提取，取續(xù)濾液定容至25 mL.取6份上述溶液，每份4 mL，分別加入混合對照品溶液2 mL，甲醇溶液2 mL和25%鹽酸溶液2 mL于具塞試管中進(jìn)行酸化處理，0.45 μm濾膜濾過，得供試品溶液.按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，進(jìn)樣10 μL，測定槲皮素、山奈酚和異鼠李素的量，計(jì)算槲皮素的回收率為(99.84%±0.23)%，RSD值為0.24%(n=6)；山奈酚的回收率為100.20%±0.52%，RSD值為0.38%(n=6)，異鼠李素的回收率為(99.99%±0.12)%，RSD值為0.11%，表明該測定結(jié)果準(zhǔn)確.

表1 曇花中槲皮素、山奈酚和異鼠李素的回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.5 測定

取供試品溶液，進(jìn)樣10 μL按“2.1”下色譜條件進(jìn)樣分析并記錄峰面積.HPLC測定結(jié)果見圖1，表2.曇花中含槲皮素、異鼠李素和山奈酚的量分別為0.05、0.026、0.039 mg/g.

圖1 對照品與供試品的HPLC色譜圖A—對照品；B—供試品 1—槲皮素；2—山奈酚；3—異鼠李素

表2 曇花中含槲皮素、山奈酚、異鼠李素的量

3 結(jié) 語

本文采用一測多評，建立高效液相色譜法同時(shí)測定曇花中含槲皮素、異鼠李素和山奈酚的量的方法，操作簡單、靈敏、重復(fù)性好，能夠更加有效、全面、準(zhǔn)確地控制曇花及其制劑的質(zhì)量.一測多評的研究方法實(shí)現(xiàn)了中藥多成分定量，更加符合傳統(tǒng)中醫(yī)理論的整體觀，為中藥多指標(biāo)質(zhì)量評價(jià)提供了新的研究思路，將越來越廣泛地應(yīng)用于中藥科研和生產(chǎn)實(shí)踐過程中，成為中藥質(zhì)量控制和評價(jià)模式發(fā)展新趨勢.參考文獻(xiàn)：

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Simultaneous determination of quercetin, kaempferol and isorhamnetin in Epiphyllum oxypetalum by HPLC

ZOU Xiang1, SHENG Jie-jing2, QU Zhong-yuan2, ZHANG Zhen-guo3, XU Yang3, JI Yu-bin1

(1. PostDoctoral Research Center of Material Medica, Harbin University of Commrce, Harbin 150076, China;2.School of Pharmacy, Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China; 3. Honours School,Harbin University of Commerce, Harbin 150028, China)

A rapid and sensitive HPLC method was developed to detect the content of quercetin, kaempferol and isorhamnetin in Epiphyllum oxypetalum. Diamond-C18column was used as chromatographic column, methanol-0.4% phosphoric acid (55∶45) water solution as mobile phase, and the detection wavelength was set at 360 nm, with a flow rate at 1.0 mL/min. There was a good linear relationship when quercetin was in the range of 5.5～88 μg/mL,r=0.999 9(n=6), kaempferol was in the range of 4～64 μg/mL,r=0.999 9(n=6) and isorhamnetin was in the range of 6.5～104 μg/mL,r=0.999 9(n=6). The average recoveries were (99.84±0.23)% (RSD=0.24%), (100.20±0.52)% (RSD=0.38%), 99.99±0.12% (RSD=0.11%) respectively. The result showed that the content of quercetin, kaempferol and isorhamnetin in Epiphyllum oxypetalum were 0.05, 0.026, 0.039 mg/g, respectively. The established method was simple, sensitive and reproducible to detect the content of quercetin, kaempferol and isorhamnetin in Epiphyllum oxypetalum at the same time, which could be applied in the quality control of Epiphyllum oxypetalum and its preparations.

Epiphyllum oxypetalum; quercetin; kaempferol; isorhamnetin; HPLC

2015-06-02.

國家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目(81102858)；黑龍江省普通本科高等學(xué)校青年創(chuàng)新人才培養(yǎng)計(jì)劃(UNPYSCT-2015070)；黑龍江省博士后資助項(xiàng)目(LBH-Z11102)；哈爾濱商業(yè)大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃國家級項(xiàng)目(201410240007)

鄒 翔(1978-)，男，博士，副研究員，研究方向：抗腫瘤天然藥物研究.

R284

A

1672-0946(2015)05-0513-03