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HPLC法測(cè)定槲寄生中N-桂皮?;《?/h1>
2015-03-10 01:35:31孫永慧
關(guān)鍵詞:槲寄生二胺桂皮

孫永慧,郎 悅,張 穎

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 中醫(yī)藥研究院,哈爾濱 150040)

HPLC法測(cè)定槲寄生中N-桂皮?;《?/p>

孫永慧,郎 悅,張 穎

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 中醫(yī)藥研究院,哈爾濱 150040)

建立HPLC法測(cè)定槲寄生中N-桂皮?;《返牧康姆椒?采用高效液相色譜法檢測(cè),DiamonsilTMC18色譜柱(5.6×250 mm,5 μm);以乙腈-0.2%磷酸溶液(20∶80)為流動(dòng)相;檢測(cè)波長(zhǎng):278 nm;流速:1.0mL/min;柱溫:25 ℃. N-桂皮?;《吩?.1~0.5 μg(r=0.999 8)范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系;平均回收率為98.3%(n=6),RSD=0.8%.該測(cè)定方法準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、靈敏度高、重現(xiàn)性好,可作為該藥材的質(zhì)量控制方法.

槲寄生;N-桂皮?;《罚桓咝б合嗌V

槲寄生是桑寄生科槲寄生屬植物,主要含有黃酮、三萜、生物堿等成分.具有祛風(fēng)濕、強(qiáng)筋骨、補(bǔ)肝腎、安胎元的功效,用于風(fēng)濕痹痛,筋骨無(wú)力,崩漏經(jīng)多,妊娠漏血,腰膝酸軟,胎動(dòng)不安,頭暈?zāi)垦5劝Y[1].據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,槲寄生屬植物具有抗心律失常、抗病毒、抗氧化等多種作用[2],槲寄生生物堿抗腫瘤活性很強(qiáng)[3].本實(shí)驗(yàn)測(cè)定了槲寄生中生物堿類成分N-桂皮?;《返牧縖4-5],為評(píng)價(jià)槲寄生質(zhì)量提供了參考.

1 儀器與試藥

Waters 2695-2998型高效液相色譜儀(美國(guó)沃特斯公司);CPA225D電子天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司).槲寄生(哈爾濱順合大藥房有限公司);N-桂皮酰基丁二胺(從槲寄生中分離得到,經(jīng)MS、1H-NMR、13C-NMR鑒定結(jié)構(gòu),HPLC歸一化法測(cè)定質(zhì)量分?jǐn)?shù)在98.0%以上);乙腈(色譜純,美國(guó)Tedia公司);其他試劑(分析純).

2 方法及結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱型號(hào):DiamonsilTMC18(5μm,5.6×250 mm);流動(dòng)相:乙腈-0.2%磷酸溶液(20∶80);檢測(cè)波長(zhǎng)是278 nm;流速為1.0 mL/min;柱溫是25 ℃.HPLC色譜圖見(jiàn)圖1、2.

圖1 N-桂皮?;《穼?duì)照品HPLC圖

圖2 槲寄生藥材HPLC圖

2.2 制備供試品溶液

取干燥的槲寄生藥材粗粉5 g,用分析天平精密稱定質(zhì)量,用75%的乙醇溶液50 mL回流提取2 h,濾過(guò),取濾液,濃縮提取液至無(wú)醇味,然后加入水15 mL,用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值至2~3,濾過(guò),取濾液,用濃氨水調(diào)pH值至9~10,再用三氯甲烷提取3次,每次20 mL,合并三氯甲烷提取液,蒸干,用色譜甲醇定容至5 mL的量瓶中,用微孔濾膜(0.45 μm)濾過(guò),得到待測(cè)供試品溶液.

2.3 制備對(duì)照品溶液

稱取自制的N-桂皮?;《穼?duì)照品2.5 mg,精密稱定重量,置于50 mL容量瓶中,精密加甲醇至刻度,制成質(zhì)量濃度為0.05 mg/mL的N-

桂皮酰基丁二胺對(duì)照品溶液.

2.4 測(cè)定線性范圍及制備標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別精密吸取N-桂皮?;《穼?duì)照品溶液2、4、6、8、10、12 μL,按前述2.1項(xiàng)下的色譜條件,注入液相色譜儀中,進(jìn)行色譜峰面積測(cè)定,將測(cè)得的對(duì)照品色譜峰面積數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸,以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo),以對(duì)照品色譜峰峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到回歸方程是:Y=2.2×106X-10 789(r=0.999 8),上述結(jié)果顯示:N-桂皮?;《穼?duì)照品進(jìn)樣量在0.1~0.6 μg之間呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系.

2.5 精密度試驗(yàn)

分別精密吸取N-桂皮?;《穼?duì)照品溶液10 μL,按照前述2.1項(xiàng)下的色譜條件,進(jìn)樣測(cè)定,連續(xù)進(jìn)樣6次,記錄對(duì)照品峰面積,結(jié)果峰面積值的RSD為1.6 %,結(jié)果說(shuō)明儀器精密度較高,測(cè)定結(jié)果可靠.

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取前述2.2項(xiàng)下制備的槲寄生供試品溶液,按照設(shè)定的時(shí)間間隔分別進(jìn)樣測(cè)定.時(shí)間間隔如下:0、2、4、6、8、12 h.按照前述2.1項(xiàng)下的色譜條件,進(jìn)樣測(cè)定,每次進(jìn)樣10 μL,記錄峰面積,結(jié)果顯示,槲寄生供試品溶液在12 h之內(nèi)是穩(wěn)定的,RSD為1.7%.

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取槲寄生藥材粉末6份,每份大約5 g,精密稱定質(zhì)量,按前述2.2項(xiàng)下方法提取制備槲寄生供試品溶液并進(jìn)行測(cè)定,計(jì)算6批供試品中N-桂皮?;《返牧?,結(jié)果N-桂皮酰基丁二胺的量平均值為0.062 5 mg/g,RSD為1.5%.試驗(yàn)結(jié)果表明,本方法重復(fù)性良好.

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

取槲寄生藥材粉末6份,每份大約2.5 g,精密稱定重量,每份供試品分別加入N-桂皮?;《穼?duì)照品0.15 mg(精密加入配制的質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的對(duì)照溶液1.50 mL),按照前述2.2項(xiàng)下供試品溶液制備方法制得待測(cè)加樣回收率的樣品溶液,注入液相色譜儀,依前述2.1項(xiàng)下色譜條件法進(jìn)樣檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1.測(cè)定結(jié)果表明,該測(cè)定方法回收率較好,測(cè)定結(jié)果可靠.

表1 加樣回收率測(cè)定結(jié)果

取樣量/g樣品中的量/mg對(duì)照品加入量/mg測(cè)得量/mg回收率/%回收率平均值/%RSD/%2.50590.15660.15000.305699.32.51060.15690.15000.304598.42.49260.15580.15000.304499.12.50070.15630.15000.301997.12.50820.15680.15000.303898.02.51910.15740.15000.304197.898.30.8

2.9 樣品測(cè)定

取6批槲寄生藥材,分別粉成細(xì)粉,按前述2.2項(xiàng)下方法制備槲寄生供試品溶液,分別精密吸取前述2.3項(xiàng)下的對(duì)照品溶液與槲寄生藥材供試品溶液各10 μL,按照前述2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,結(jié)果見(jiàn)表2.

表2 槲寄生藥材測(cè)定結(jié)果

批號(hào)取樣量/gN-桂皮酰基丁二胺的量/(mg·g-1)平均值/(mg·g-1)RSD/%201309015.05840.0659201309025.03360.0615201309034.94200.0641201309045.06110.0628201309054.99710.0631201309065.10740.06030.06252.4

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)采用了高效液相色譜法進(jìn)行了N-桂皮酰基丁二胺的量測(cè)定,由于槲寄生生物堿類成分復(fù)雜,高效液相色譜測(cè)定干擾較多,因此本實(shí)驗(yàn)采用酸溶堿沉有機(jī)溶劑提取法提取純化槲寄生總生物堿.

經(jīng)紫外掃描N-桂皮?;《吩?78 nm有最大吸收且干擾最小,因此本實(shí)驗(yàn)測(cè)定波長(zhǎng)確定為278 nm.實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)磷酸溶液的酸度及用量對(duì)分離效果有較大影響,以乙腈-0.2%磷酸水為流動(dòng)相,流動(dòng)相比例為20∶80時(shí),色譜峰分離效果較好,峰形及相鄰峰分離良好.

采用HPLC測(cè)定槲寄生藥材中N-桂皮?;《返牧?,對(duì)于評(píng)價(jià)槲寄生的質(zhì)量具有較大意義,為槲寄生生物堿類的開(kāi)發(fā)利用提供了科學(xué)依據(jù).

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)藥典[M]. 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社, 2010. 348.

[2] 張水仙,劉 越,孫洪波,等.槲寄生化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J].中藥材, 2011, 34(12): 1962-1967.

[3] 彭海燕, 章永紅, 韓 英, 等. 槲寄生堿抗腫瘤作用的研究[J]. 中國(guó)中藥雜志, 2005, 30(5): 381-382.

[4] 孫永慧, 凌 勇, 張 嵩, 等. 不同寄主紅果槲寄生中總生物堿的含量測(cè)定[J]. 中醫(yī)藥信息, 2009, 26(3): 15-16.

[5] 孫永慧, 凌 勇, 任美榮, 等. 紅果槲寄生的化學(xué)成分研究[J].中草藥, 2010, 41(9): 1418- 1420.

Determination of N-cinnamoyl putrescine in Viscum coloratum (Kom.) Nakai by HPLC

SUN Yong-hui, LANG Yue, ZHANG Ying

(Academy of Chinese Medicine, Heilongjiang University of Traditional Chinese Medicine, Harbin 150040, China)

An assay method was established for the determination of N-cinnamoyl putrescine in Viscum coloratum (Kom.) Nakai by HPLC. DiamonsilTMC18analytical column (250 mm×5.6 mm, 5 μm) was used with a mobile phase of aceronitrile-0.2% H3PO4(20∶80). The flow rate was 1.0 mL/min. The detecting wavelength was at 278 nm. The column temperature was at 25 ℃. The linear range of N-cinnamoyl putrescine was 0.1~0.5 μg (r=0.999 8).The average recovery was 99.9%.RSD=1.80%. The method was accurate, simple, highly sensitive and reproducible. It can be used for the quality control of Visum coloratum (Kom.) Nakai.

Viscum coloratum (Kom.) Nakai; N-cinnamoyl putrescine; HPLC

2014-12-07.

黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(12531635)

孫永慧(1974-),女,博士,副研究員,研究方向:中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究.

R284

A

1672-0946(2015)05-0530-03

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