鄒淑君，許樹軍，張 蕾，徐 暘

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，哈爾濱 150040)

銅(II)離子對橙皮素清除自由基作用的影響

鄒淑君，許樹軍，張 蕾，徐 暘

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，哈爾濱 150040)

為探討Cu2+存在對橙皮素(Hsp)清除自由基作用的影響.將Hsp與Cu2+混合即生成不穩(wěn)定配合物(Hsp-Cu)，利用UV-Vis光譜測定Hsp及Hsp-Cu對1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基(DPPH·)、羥基自由基(·OH)、超氧陰離子自由基(O2-·)的清除作用.在實驗條件下Hsp-Cu對DPPH·及·OH有一定的清除作用，但清除能力不如Hsp.Hsp-Cu不能有效清除O2-·，且在鄰苯三酚自氧化過程中表現(xiàn)出促氧化作用.表明Hsp作為抗氧化劑使用時，應(yīng)避免與Cu2+接觸，以免影響其抗氧化能力.

橙皮素；銅(II)離子；自由基；清除

橙皮素(簡寫為Hsp)，分子式C16H14O6，化學(xué)名5,7,3′-三羥基-4′-甲氧基二氫黃酮，為柑橘果實中主要活性成分橙皮苷的水解產(chǎn)物.國內(nèi)在醫(yī)藥方面，主要療效有健胃、祛痰、鎮(zhèn)咳、驅(qū)風(fēng)、利尿、止逆和止胃痛等[1].在國外，橙皮素用做心血管保健藥物，也做為抗氧化劑用于化妝品和食品添加劑中[2].可見橙皮素有著廣泛的應(yīng)用.橙皮素分子具有4-羰基、5-羥基結(jié)構(gòu)，理論上易與過渡金屬離子配位形成配合物.銅是常見的過渡金屬元素，也是人體重要的必需微量元素之一，與機體內(nèi)的抗氧化關(guān)系密切[3].許多文獻(xiàn)報道黃酮類化合物能與與金屬配位，且配位后對自由基的清除作用均明顯高于黃酮本身[4-5].但也有文獻(xiàn)指出：黃酮類化合物具有抗氧化和促氧化的雙重作用，Cu2+、Fe3+等過渡金屬離子是黃酮類化合物促氧化作用的重要因素[6].因此，本實驗?zāi)M生理pH條件下將橙皮素與銅(II)離子混合(簡寫為Hsp-Cu)，分析其是否存在配位作用，并對比測試有無銅(II)離子存在下其對自由基的清除作用，以考察Cu2+的引入對橙皮素抗氧化作用的影響，為橙皮素的合理應(yīng)用開發(fā)提供實驗依據(jù).

1 試劑與儀器

1.1 藥品與試劑

橙皮素(Hsp 98%，上海晶純實業(yè)有限公司)；DPPH(98%，日本東京化成株式會社)；三羥甲基氨基甲烷 (簡稱Tris ，99.8%，上海博宏生物科技有限公司)；其他試劑均為國產(chǎn)分析純.

1.2 儀器

UV-1601型紫外可見分光光度計(日本島津)；PB-20型pH計(德國賽多利斯)；SK250LH型超聲波清洗器(上?？茖?dǎo))；XS105DU型電子分析天平(瑞士梅特勒).

1.3 實驗方法

1.3.1Hsp與銅(II)離子的混合

按物質(zhì)的量比l∶l將氯化銅的乙醇溶液在攪拌下緩慢滴加到橙皮素乙醇溶液中，用Tris-HCl緩沖液調(diào)至生理pH=7.4左右，有沉淀產(chǎn)生，室溫下攪拌2 h，靜置，離心，沉淀物用乙醇洗滌，干燥得暗黃綠色固體(定為Hsp-Cu).

1.3.2對DPPH·自由基的清除作用

根據(jù)Hsp及Hsp-Cu的溶解度情況，確定配制二者初始溶液質(zhì)量濃度為0.08 mg/mL，分別取兩種溶液0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于不同比色管中，去離子水定容至10 mL作為不同質(zhì)量濃度的待測樣品；6.5×10-5mol/L的DPPH·溶液為供試液.均以去離子水為參比，于517 nm下測試，且待測液均在40 ℃時避光恒溫30 min后進(jìn)行測試.測得等體積去離子水與DPPH·溶液混勻后的吸光度A0；等體積待測樣品溶液與DPPH·溶液混勻后的吸光度Ai；等體積待測樣品溶液與去離子水混勻后的吸光度Aj.根據(jù)抑制率=[1-(Ai-Aj)/A0] ×100%進(jìn)行計算，以測試時樣品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)對抑制率作圖[5, 7].

1.3.3對·OH自由基的清除作用

待測樣品初始質(zhì)量濃度同1.2.2項下.另配制2 mmol/L硫酸亞鐵銨溶液、3 mmol/L的H2O2溶液、6 mmol/L水楊酸溶液作供試液.均于510 nm下測吸光度.在比色管中依次加入硫酸亞鐵銨溶液3 mL、H2O2溶液1 mL，搖勻，37 ℃水浴加熱15 min后，加入水楊酸溶液3 mL，再于37 ℃水浴繼續(xù)加熱15 min后加去離子水定容至25.0 mL，測定吸光度A0；另在不同的比色管中分別加入硫酸亞鐵銨溶液3 mL、H2O2溶液1 mL，搖勻，分別加入待測樣品溶液為1.0、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL，于37 ℃水浴加熱15 min后再加入水楊酸溶液3 mL，繼續(xù)水浴加熱15 min后去離子水定容至25.0 mL，測吸光度Af.按清除率=[(A0-Af)/A0]×100%進(jìn)行計算，以測試時樣品質(zhì)量濃度對清除率作圖[5, 7].

1.3.4對O2-·的清除作用

待測樣品初始質(zhì)量濃度同1.2.2項下.另配制pH值為8.2的Tris-HCl緩沖溶液、3 mmol/L的鄰苯三酚溶液作供試液.均于320 nm下測吸光度.等體積Tris-HCl緩沖溶液與去離子水混合做空白溶液，向10 mL比色管中加入Tris-HCl緩沖溶液5.0 mL、去離子水4.7 mL及鄰苯三酚溶液0.3 mL混勻，測定吸光度，計算不加待測液時鄰苯三酚自氧化速率v0.向兩組不同的比色管中加入Tris-HCl緩沖溶液5.0 mL、待測樣品溶液分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，其中一組加去離子水定容至10 mL做空白溶液；另一組加鄰苯三酚溶液0.3 mL、并迅速加去離子水定容至10 mL搖勻測吸光度，計算加待測液時鄰苯三酚自氧化速率vc.測定吸光度時均每30 s記錄1次，直到反應(yīng)啟動后3 min結(jié)束.以時間為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸得到直線斜率即為v0和vc[7].

1.3.5數(shù)據(jù)處理分析

測試結(jié)果用Origin8.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析并作圖.

2 結(jié)果分析

2.1 Hsp-Cu及Hsp的紫外-可見光譜

Hsp可溶于甲醇、乙醇、DMSO(二甲基亞砜)、DMF(氮氮二甲基甲酰胺)中，難溶于水；Hsp-Cu難溶于甲醇、乙醇，微溶于水，可溶于DMSO、DMF中.因此將二者溶解于DMSO中進(jìn)行測試.圖1為紫外可見光譜曲線.可見Hsp最大吸收波長為290 nm，在331 nm處有一較低的肩峰.Hsp-Cu有2個峰，且均向長波方向移動，吸收波長分別移至307 nm和371 nm，說明Hsp與Cu2+進(jìn)行了配位.即橙皮素與Cu2+在pH=7.4的條件下可發(fā)生配位作用.

圖1 Hsp-Cu及Hsp的紫外-可見光譜

但是將Hsp-Cu放置，隨著時間的延長，發(fā)現(xiàn)Hsp-Cu所呈現(xiàn)的吸收峰逐漸降低，直至約36 h左右消失，最后呈現(xiàn)出Hsp峰.說明Hsp與Cu2+生成的配合物不穩(wěn)定，容易分解.

2.2 Hsp-Cu及Hsp對DPPH·自由基的清除作用

Hsp-Cu和Hsp對DPPH·的抑制作用比較結(jié)果如圖2所示.

圖2 Hsp-Cu及Hsp對DPPH·自由基的清除作用

由圖2可見，Hsp對DPPH·有較好的清除能力，清除率隨著Hsp質(zhì)量濃度的增大而增大，呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系.Hsp-Cu對DPPH·的清除率也隨著質(zhì)量濃度的增大而增大，呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系，但清除能力明顯弱于Hsp.

2.3 Hsp-Cu及Hsp對·OH自由基的清除作用

圖3是Hsp-Cu和Hsp對·OH自由基清除作用比較結(jié)果.

從圖3可見，在實驗濃度范圍內(nèi)，Hsp對·OH自由基有較好的清除作用，清除率隨濃度的增大而變大，呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系.Hsp-Cu對·OH具有一定的清除能力，但整體表現(xiàn)Hsp-Cu對·OH的清除能力明顯不如Hsp.

圖3 Hsp-Cu及Hsp對羥基自由基的清除作用

2.4 Hsp-Cu及Hsp對O2-·的清除作用

在本實驗測試條件下測得不加待測樣品時鄰苯三酚自氧化速率v0=151×10-5s-1.表1是鄰苯三酚在不同質(zhì)量濃度Hsp-Cu(以Hsp的含量計)及Hsp存在下的自氧化速率.

表1 不同質(zhì)量濃度Hsp-Cu及Hsp存在下鄰苯三酚自氧化速率 (vc×10-5·s-1)

質(zhì)量濃度/(×4．0×10-3mg·mL-1)2．04．06．08．010．012．016．020．0Hsp146144140135128120110101Hsp-Cu189202209212208194198218

從表1可見，實驗濃度下，Hsp使鄰苯三酚自氧化速率vc均比v0小，且vc隨Hsp質(zhì)量濃度增大而減小，說明Hsp對O2-·具有明顯的清除能力，隨著濃度的增大清除效果增強.但Hsp-Cu卻在鄰苯三酚自氧化過程中，vc均比v0大，起到加速氧化的作用，低濃度下，vc隨Hsp-Cu質(zhì)量濃度增大而增大；高濃度下，關(guān)系不穩(wěn)定，總之，Hsp-Cu在鄰苯三酚自氧化體系中起到了促氧化作用.

3 討 論

橙皮素是一種二氫黃酮類化合物，從其結(jié)構(gòu)來看，其清除自由基活性能力由5,7,3′位三個羥基提供.但由于4′位是-OCH3，所以3′-OH清除自由基的活性應(yīng)該較弱.按文獻(xiàn)分析，橙皮素清除自由基活性能力主要是由A環(huán)的5，7位羥基提供的,且A環(huán)5-OH對抗氧化活性貢獻(xiàn)較大[8].當(dāng)5-OH和4-C=O共同與Cu2+發(fā)生配位形成橙皮素銅(Ⅱ)配合物后，體系供氫能力減弱，配合物若共面性不強，供電子能力也減弱，所以其清除自由基活性降低；另外，由于配合物不穩(wěn)定，在實驗體系中配合物中解離出的Cu2+也會降低體系對DPPH·和·OH的清除能力，這一點與文獻(xiàn)相符[9].至于橙皮素銅(Ⅱ)配合物加速鄰苯三酚自氧化過程，可能是解離出的Cu2+催化鄰苯三酚自氧化起了主導(dǎo)作用[10-11]，也可能是Cu2+對橙皮素起到促氧化作用[4]，具體機理有待進(jìn)一步研究.可見，Cu2+的引入，降低了橙皮素的抗氧化活性，甚至可能促進(jìn)氧化.因此，橙皮素作為抗氧化劑應(yīng)用于食品或藥品時，應(yīng)盡量避免與Cu2+接觸，以免生成配合物而影響其抗氧化能力.

[1] CAI Y, Q LUO, SUN M,etal. Antioxidant activity and phenolic compounds of112 traditional Chinese medicinal plants associated with anticancer [J]. Life Sciences, 2004, 74(17): 2157-2184.

[2] 徐 春, 徐萌萌, 王建芳, 等. 橙皮素的藥效研究及應(yīng)用[J]. 天然產(chǎn)物分離, 2006, 4(6): 1-4.

[3] 李萬立, 羅海吉. 微量元素銅與人類疾病關(guān)系的研究進(jìn)展[J]. 微量元素與健康研究, 2008, 25(1): 62-65.

[4] 譚 君, 王伯初, 祝連彩. 槲皮素銅(II)配合物清除自由基活性的研究[J]. 時珍國醫(yī)國藥, 2007, 18(4): 800-801.

[5] 任志秋, 陳 平. 橙皮苷鋅配合物合成及清除自由基能力的研究[J].哈爾濱商業(yè)大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版, 2009, 25(6): 688-693.

[6] 龔金炎, 洪 輝, 吳曉琴, 等. 黃酮類化合物的促氧化作用及其細(xì)胞毒性研究進(jìn)展[J]. 中草藥, 2008, 39(12): 1905-1909.

[7] 鄒淑君, 于子惠, 許樹軍, 等. 橙皮苷及橙皮素清除自由基活性的研究[J]. 中醫(yī)藥學(xué)報, 2013, 41(1): 65-67.

[8] 馮 濤, 莊海寧. 黃酮類化合物結(jié)構(gòu)特征與抗氧化性關(guān)系研究進(jìn)展[J]. 糧食與油脂, 2008(10): 8-11.

[9] 閆家凱, 張國文, 周 佳, 等. 不同因素對夏枯草總黃酮穩(wěn)定性及DPPH自由基清除活性的影響[J]. 南昌大學(xué)學(xué)報(理科版), 2012, 36(4): 341-346.

[10] 劉杏戀, 孫領(lǐng)霞, 王春霞, 等. 金屬離子對連苯三酚自氧化法測SOD活性的干擾及消除[J]. 河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報, 1997, 18(6): 346-348.

[11] 徐 陽，鄒 翔，曲中原，等.天然藥物有效成分抗氧化作用及機制研究[J]. 哈爾濱商業(yè)大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2015，31(3)：259-262.

Study on effect of copper (II) ion on radical scavenging of hesperetin

ZOU Shu-jun, XU Shu-jun, ZHANG Lei, XU Yang

(School of Pharmacy, Heilongjiang University of Traditional Chinese Medicine, Harbin 150040, China)

To study the affection of Copper (II) ions on radical scavenging of hesperetin. Unstable hesperetin-copper (II) complex was generated when hesperetin was mixed with copper (II) chloride dihydrate. By the contrast tests on the scavenging reaction to DPPH radical, hydroxyl radical (·OH), and superoxide free radical (O2-·) of hesperetin-copper (II) complex and hesperetin, proves that the scavenging activity of DPPH·and·OH of hesperetin-copper (II) complex was weaker than that of hesperetin. The hesperetin-copper (II) complex can’t scavenge O2-·showing accelerated oxidation in the process of pyrogallol autoxidation. Hesperetin was used as an antioxidant, cannot coexist with Cu2+, so as not to affect the antioxidant capacity of hesperetin.

hesperetin; copper (II) ion; free radical; scavenging

2014-11-28.

黑龍江省教育廳資助項目(12531648)；黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)?；鹂蒲姓n題(201103)

鄒淑君(1974-)，女，博士，副教授，研究方向：藥物分析研究.

R285

A

1672-0946(2015)05-0527-03