梁宗英 侯繼申 董曉利 張召 張旭 辛國(guó)華

大蒜素干預(yù)下大鼠血清對(duì)食管癌EC109細(xì)胞凋亡及Survivin表達(dá)的影響

梁宗英 侯繼申 董曉利 張召 張旭 辛國(guó)華

目的 研究大蒜素干預(yù)下SD大鼠血清誘導(dǎo)食管癌EC109細(xì)胞凋亡及其對(duì)Survivin蛋白表達(dá)的影響。方法 Ⅰ組:以普通滅活SD大鼠血清培養(yǎng)液培養(yǎng)食管癌EC109細(xì)胞;Ⅱ組:以大蒜素干預(yù)SD大鼠滅活血清培養(yǎng)液培養(yǎng)食管癌EC109細(xì)胞;采用AnnexinⅤ-EGFP/PI雙染法和亞倍體峰法應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)2組食管癌細(xì)胞早期和中晚期凋亡率;Survivin蛋白的表達(dá)應(yīng)用Western blot方法檢測(cè)。結(jié)果 Ⅱ組細(xì)胞凋亡率明顯高于Ⅰ組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜＜0.05);Ⅱ組細(xì)胞中Survivin蛋白的表達(dá)水平明顯低于Ⅰ組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論 長(zhǎng)期大蒜素干預(yù)下SD大鼠血清能促進(jìn)食管癌EC109細(xì)胞的凋亡并抑制Survivin蛋白的表達(dá)。

大蒜素;大鼠;食管癌;EC109細(xì)胞;細(xì)胞凋亡;Survivin蛋白

大蒜素的主要成分為二烯丙基三硫化物，是從食用大蒜中提取出的一種具有多種生物活性的混合物［1］。研究發(fā)現(xiàn)，在大蒜素具有的多種生物學(xué)活性中，除抗菌殺毒、降血脂以及增加機(jī)體免疫力等常規(guī)功能外，抗腫瘤的作用最為重要［2］。近幾年有學(xué)者對(duì)大蒜素抗癌作用的分子機(jī)制進(jìn)行了廣泛深入的研究探討，但大蒜素對(duì)食管癌細(xì)胞的凋亡以及Survivin蛋白表達(dá)是否有影響研究較少。為了進(jìn)一步研究探討大蒜素的抗癌機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了應(yīng)用長(zhǎng)期大蒜素干預(yù)下SD大鼠血清誘導(dǎo)食管癌EC109細(xì)胞凋亡及其對(duì)Survivin蛋白表達(dá)的影響研究，為其在食管癌防治中的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 SD大鼠購(gòu)于天津醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。食管癌EC109細(xì)胞株來(lái)自西安交通大學(xué)研究生教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心。大蒜素購(gòu)于徐州萊恩藥業(yè)有限公司(規(guī)格:2.5 g/瓶;劑型:粉末)。AnnexinⅤ-EGFP ＜ 試劑盒購(gòu)于沈陽(yáng)萬(wàn)類(lèi)生物科技發(fā)展有限公司。小鼠抗人Survivin單克隆抗體購(gòu)于天津金橋生物技術(shù)有限公司。β-Actin一抗和山羊抗小鼠二抗購(gòu)于美國(guó) Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 血清制備:40只大鼠，正常飼養(yǎng)，無(wú)特殊處理。每日給予大蒜素15 mg·kg-1·d-1，肌內(nèi)注射。24周后，取大鼠內(nèi)眥靜脈血，溫浴離心后，分離血清。高溫水浴滅活血清，過(guò)濾除菌后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組:Ⅰ組:以含20%普通SD大鼠滅活血清培養(yǎng)液培養(yǎng)食管癌EC109細(xì)胞;Ⅱ組:以含20%大蒜素干預(yù)SD大鼠滅活血清培養(yǎng)液培養(yǎng)食管癌EC109細(xì)胞。

1.2.3 細(xì)胞凋亡率的測(cè)定:應(yīng)用含有兩種血清的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞。加入PBS離心，細(xì)胞計(jì)數(shù)后調(diào)成設(shè)定濃度。取細(xì)胞懸液，分別加入AnnexinⅤ-EGFP和PI進(jìn)行染色后應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡率。同樣方法收集2組培養(yǎng)成功的細(xì)胞，加入乙醇后固定，4℃離心棄凈乙醇，加入磷酸鹽/檸檬酸鹽緩沖液，室溫下間歇搖動(dòng)，再次離心棄去上清，加入PI染色，室溫避光15 min后檢測(cè)細(xì)胞中晚期凋亡率。

1.2.4 Survivin蛋白的表達(dá):取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶，應(yīng)用含有兩種不同血清的細(xì)胞培養(yǎng)液處理細(xì)胞后，提取細(xì)胞蛋白質(zhì)后，進(jìn)行分離及濃度測(cè)定;蛋白穩(wěn)壓電泳后，以2 mA/cm2恒流轉(zhuǎn)膜;用含0.25%脫脂奶粉封閉液中，室溫?fù)u動(dòng)2 h;加一抗4℃孵育過(guò)夜;應(yīng)用TBST緩沖液洗膜后加入二抗室溫孵育2 h，洗膜后應(yīng)用ECL發(fā)光法，顯像膠片采用薄層色譜掃描儀來(lái)測(cè)定印跡區(qū)帶的光密度值。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞的凋亡 Ⅱ組早期凋亡率明顯高于Ⅰ組，2組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);而Ⅱ組中晚期細(xì)胞凋亡率較Ⅰ組仍明顯增高，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異有意義(P＜0.05)。見(jiàn)表1，圖1～4。

表1 2組食管癌EC109細(xì)胞凋亡率比較%，±s

表1 2組食管癌EC109細(xì)胞凋亡率比較%，±s

注:與Ⅰ組比較，*P ＜0.05

組別 凋亡率早期凋亡率 中晚期凋亡率Ⅰ組2.98±0.93 0.91±0.22Ⅱ組 7.72±1.31* 12.42±1.43*

圖1 Ⅰ組EC109細(xì)胞早期細(xì)胞凋亡率(Annexin V-EGFP/PI法)

圖2 Ⅱ組EC109細(xì)胞早期細(xì)胞凋亡率(Annexin V-EGFP/PI法)

圖3 Ⅰ組EC109細(xì)胞中晚期細(xì)胞凋亡率(亞倍體峰法)

圖4 Ⅱ組EC109細(xì)胞中晚期細(xì)胞凋亡率(亞倍體峰法)

2.2 Survivin蛋白的表達(dá) 對(duì)曝光X線(xiàn)片掃描后，應(yīng)用凝膠圖像分析處理軟件處理后結(jié)果顯示，Ⅱ組 Survivin蛋白表達(dá)量明顯低于Ⅰ組。見(jiàn)圖5。

3 討論

食管癌是人類(lèi)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，近年來(lái)全球食管癌的發(fā)病率和死亡率呈上升趨勢(shì)［3］。我國(guó)一直是食管癌的高發(fā)地區(qū)，食管癌發(fā)病率和死亡率均居世界之首［4］。目前食管癌的治療仍以手術(shù)、放化療為主要手段，盡管有一定療效，但常常對(duì)機(jī)體產(chǎn)生嚴(yán)重的不良反應(yīng)［5］。因此，加強(qiáng)對(duì)食管癌藥物預(yù)防以及治療的深入研究，改善食管癌患者的生存質(zhì)量，延長(zhǎng)患者的生存期是臨床工作者面臨的首要任務(wù)。近幾年有學(xué)者對(duì)大蒜素抗癌作用的分子機(jī)制進(jìn)行了廣泛深入的研究探討，但大蒜素對(duì)食管癌細(xì)胞的增殖以及凋亡是否有影響研究較少。研究食管癌的病因、發(fā)展轉(zhuǎn)移機(jī)制及對(duì)藥物的反應(yīng)性，對(duì)食管癌的防治有重要意義［6］。

圖5 EC109細(xì)胞Survivin蛋白表達(dá)水平

細(xì)胞凋亡是多細(xì)胞生物最常見(jiàn)的一種基本生命活動(dòng)，是機(jī)體維持正常生理活動(dòng)所必需的，對(duì)機(jī)體正常功能的維持具有重要意義［7］。無(wú)限的細(xì)胞增殖并不是人體腫瘤發(fā)生的原因，人類(lèi)某些腫瘤發(fā)生的最主要原因的通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡途徑或凋亡功能的喪失導(dǎo)致的增殖與凋亡之間的失衡造成的。通過(guò)強(qiáng)化凋亡基因活性的表達(dá)、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡達(dá)到殺死或者加速腫瘤細(xì)胞的死亡是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)防癌、抗癌藥物發(fā)揮其功能的重要途徑。在諸多抑制和影響細(xì)胞凋亡的因素中，作用最強(qiáng)研究最多的是Survivin蛋白。Survivin蛋白是一種在人體正常分化組織中不表達(dá)而在腫瘤組織中普遍表達(dá)的，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞分化和抑制細(xì)胞凋亡雙重功能的小分子量肽類(lèi)［8］。Survivin通過(guò)下調(diào)腫瘤細(xì)胞 Survivin蛋白的表達(dá)量和抑制相關(guān)蛋白的功能而實(shí)現(xiàn)其強(qiáng)大的抗凋亡作用，從而達(dá)到治療腫瘤的目的［9，10］。目前Survivin抗凋亡作用的機(jī)制主要是依賴(lài)在細(xì)胞凋亡中起核心作用的caspase直接或間接抑制起始因子而抑制凋亡，或者是Survivin基因決定簇缺失或突變而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生自發(fā)性凋亡，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)［11］。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，大蒜素的抗腫瘤機(jī)制涉及多個(gè)靶點(diǎn)，作用機(jī)制主要包括抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡壞死、抗腫瘤血管生成、影響腫瘤細(xì)胞信號(hào)傳遞等一系列的化學(xué)預(yù)防和治療途徑。大蒜素具有抗腫瘤活性不僅表現(xiàn)在其可通過(guò)多種途徑干擾腫瘤細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而且還具有直接殺傷腫瘤細(xì)胞的能力，為應(yīng)用大蒜素治療和預(yù)防癌癥提供了理論依據(jù)［12］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:由實(shí)驗(yàn)測(cè)得的調(diào)亡率結(jié)果分析顯示，經(jīng)過(guò)大蒜素干預(yù)的實(shí)驗(yàn)鼠滅活血清培養(yǎng)的食管癌細(xì)胞凋亡率明顯高于普通血清培養(yǎng)的食管癌細(xì)胞，說(shuō)明大蒜素干預(yù)的實(shí)驗(yàn)鼠滅活血清可以促進(jìn)食管癌EC109細(xì)胞的凋亡。而且經(jīng)過(guò)Western-Blot技術(shù)驗(yàn)證，經(jīng)大蒜素干預(yù)的大鼠血清培養(yǎng)的食管癌EC109細(xì)胞Survivin蛋白的表達(dá)量較普通大鼠血清組明顯下降。說(shuō)明大蒜素可以通過(guò)某些途徑抑制Survivin基因?qū)?yīng)表達(dá)的Survivin蛋白的功能而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而達(dá)到抗腫瘤的目的。大蒜素作為一種純天然藥物，對(duì)腫瘤細(xì)胞作用的靶點(diǎn)和途徑是多方面的，與其他化療藥比較，具有對(duì)人毒性小、體內(nèi)無(wú)殘留、不易產(chǎn)生耐藥性的優(yōu)勢(shì)。隨著大蒜素抗癌作用研究日趨成熟和深入，大蒜素抑制腫瘤的增殖以及促進(jìn)凋亡的具體機(jī)制還有待進(jìn)一步深入的研究，這對(duì)更好發(fā)揮大蒜素抗腫瘤功效具有重要意義［13］。

長(zhǎng)期大蒜素干預(yù)下SD大鼠血清能促進(jìn)食管癌EC109細(xì)胞的凋亡并抑制Survivin蛋白的表達(dá)。大蒜素經(jīng)過(guò)體內(nèi)生物轉(zhuǎn)化后可以通過(guò)某些途徑促進(jìn)細(xì)胞凋亡，但促進(jìn)凋亡的具體機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究。

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The effect of rats serum treated by allicin on the apoptosis of esophagus cancer EC-109 cells and the expression levels of Survivin

LIANG Zongying* ，HOU Jishen* ，DONG Xiaoli，et al．*Department of Thoracic Surgery，Affiliated Hospital ofChengde Medical College，Hebei，Chengde 067000，China

Objective To investigate the effect of SD rats serum after intervention by allicin on the apoptosis of esophagus cancer EC-109 cells cell and the expression levels of Survivin.Methods The groupⅠ:esophagus cancer EC109 cells were cultured in normal inactivated SD rat serum medium;groupⅡ:esophagus cancer EC109 cells were cultured in inactivated SD rat serum medium plus allicin，then the cell apoptosis rates were detected by AnnexinⅤ-EGFP/PI double-standing and hypoploid peak method with flow cytometer，furthermore the expression levels of Survivin were measured by Western Blot.Results The cell apoptosis rates in groupⅡwere significantly higher than those in groupⅠgroup(P＜0.05)，however，the expression levels of Survivin protein in groupⅡ were significantly lower than those in groupⅠ(P ＜ ＜0.05).Conclusion The serum of SD rat after long-term intervention by allicin can promote the apoptosis of esophagus cancer EC109 cells and can inhibit the expression of Survivin protein.

allicin;rat;esophagus cancer;EC109 cell;cell apoptosis;Survivin protein

R 735.1

A

1002-7386(2015)23-3528-03

10．3969/j．issn．1002-7386．2015．23．002

067000 河北省承德市，承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院胸外科(梁宗英、侯繼申、張召、張旭、辛國(guó)華);河北省石家莊市優(yōu)撫醫(yī)院外一科(董曉利)

辛國(guó)華，061000 河北省承德市，承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院;E-mail:X215929@163.com

2015-07-20)