陸冬梅 楊俊紅

上皮性卵巢癌組織中HE4和CD133的表達(dá)及臨床意義

陸冬梅 楊俊紅

目的 探討人附睪蛋白HE4和CD133在上皮性卵巢癌中的表達(dá)及臨床意義。方法 收集病理標(biāo)本采用免疫組化法檢測(cè)上皮性卵巢癌組織(n=57)及正常卵巢組織(n=19)HE4和CD133的表達(dá)情況。分別研究HE4和CD133與各臨床病理參數(shù)的關(guān)系并進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果 HE4在正常卵巢組和上皮性卵巢癌組中陽(yáng)性表達(dá)率分別為42.1%(8/19)、71.9%(41/57)，CD133在2組中陽(yáng)性表達(dá)率分別為31.6%(6/19)、68.4%(34/57)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。HE4和CD133的表達(dá)均與臨床病理分期、組織分化程度、絕經(jīng)狀態(tài)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有顯著相關(guān)性(P＜0.05)。Spearman相關(guān)性分析顯示HE4表達(dá)與CD133的表達(dá)有相關(guān)性(r=0.340，P=0.006)。結(jié)論 HE4和CD133的高表達(dá)可能與上皮性卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展有一定關(guān)系。

上皮性卵巢癌;HE4;CD133;免疫組化

卵巢癌是女性三大惡性腫瘤之一，其進(jìn)展迅速，預(yù)后差［1］。卵巢癌患者起病比較隱匿，待確診時(shí)多為晚期，上皮性卵巢癌(EOC)患者的五年生存率大約為30%。腫瘤的生物學(xué)行為包括增殖、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)并涉及許多蛋白分子的表達(dá)。腫瘤標(biāo)志物HE4在臨床上已用于卵巢癌的鑒別診斷、復(fù)發(fā)和預(yù)后評(píng)價(jià)［2，3］。CD133作為腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物，與許多惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切［4-6］。本研究應(yīng)用免疫組化SP法檢測(cè)EOC組織中HE4及CD133的表達(dá)，研究它們與EOC臨床病理特征之間的關(guān)系。為探討 HE4及CD133在EOC發(fā)生發(fā)展中的生物學(xué)作用及進(jìn)一步臨床診斷和治療提供思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2011年5月至2014年5月于本院婦科門診經(jīng)病理確診并排除其他卵巢病變的上皮性卵巢癌患者病例57例，正常卵巢組織19例，收集相關(guān)臨床資料。卵巢癌患者手術(shù)時(shí)的組織標(biāo)本要避開(kāi)壞死和炎癥區(qū)域，對(duì)照組卵巢組織均來(lái)自子宮多發(fā)肌瘤同時(shí)一行卵巢切除者。所有標(biāo)本采集后立即放入10%甲醛固定液中固定，2 h內(nèi)石蠟包埋固定保存，4 μm厚度連續(xù)切片。所有病理切片均由兩位資深的病理科醫(yī)生進(jìn)行核對(duì)分析。患者年齡31～74歲，中位年齡54.1歲，TNM分期:Ⅰ～Ⅱ期19例，Ⅲ～Ⅳ期38例;病理類型:漿液性腺癌31例，粘液性腺癌12例，子宮內(nèi)膜樣腺癌14例;絕經(jīng)病例35例，未絕經(jīng)病例22例。高中分化EOC 31例，低分化EOC 26例。淋巴轉(zhuǎn)移患者36例，淋巴無(wú)轉(zhuǎn)移患者21例。所有患者未合并其他腫瘤及嚴(yán)重內(nèi)科病，組織取材前無(wú)放化療治療。

1.2 主要試劑 抗體試劑兔抗人HE4及CD133多克隆抗體工作液(Santa Cruz Biotechnology公司，美國(guó))，山羊抗兔二抗(Sigma公司，美國(guó))，SP法免疫組化試劑盒及DAB顯色試劑盒(福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司，中國(guó))。梯度乙醇、PBS緩沖液(pH值7.4)、抗原修復(fù)液、二甲苯、過(guò)氧化氫、中性樹(shù)膠等試劑均由本院病理科提供。HE4及CD133的染色具體操作步驟按照試劑盒要求進(jìn)行。

1.3 免疫組化法 采用免疫組化SP法檢測(cè)EOC及正常卵巢組織中HE4及CD133的表達(dá)量。石蠟包埋標(biāo)本經(jīng)加熱脫蠟和逐級(jí)酒精水化，切片采用微波爐加熱法95℃ 15 min進(jìn)行抗原修復(fù)，取出后室溫冷卻30 min，室溫下加入 HE4和 CD133多克隆抗體(1∶200)孵育40 min，PBS清洗3次后37℃濕盒中加二抗孵育30 min，PBS再次漂洗后加50 μl DAB顯色液，PBS漂洗3次蘇木素染核5 min。切片經(jīng)鹽酸分化后行酒精脫水，二甲苯透明，最后中性樹(shù)膠封片保存。使用試劑要求的已知免疫組化片作為陽(yáng)性對(duì)照，PBS代替一抗的免疫組化片作為陰性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) HE4及CD133均表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，免疫組化染色以黃色顆粒視為陽(yáng)性，評(píng)定原則為染色強(qiáng)度和陽(yáng)性染色細(xì)胞百分率綜合分析。初步根據(jù)染色強(qiáng)度粗略給分:無(wú)染色0分;淡黃色1分;淺褐色2分;深褐色3分。陽(yáng)性細(xì)胞百分比計(jì)分:無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞為0，1% ～25%，26% ～50%，51% ～75%，＞75%分別打分為0分，1分，2分，3分，4分。染色強(qiáng)度計(jì)分乘以陽(yáng)性細(xì)胞百分率等于蛋白表達(dá)數(shù)值，以0～2分定為陰性，陽(yáng)性表達(dá)＞3分。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)分析用Spearman檢驗(yàn)，P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 卵巢癌組織HE4的表達(dá) HE4在EOC組織中的陽(yáng)性表現(xiàn)為胞膜和胞漿內(nèi)均有棕黃色顆粒，蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為71.9%，前者明顯高于正常卵巢組織中HE4的表達(dá)率(42.1%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)圖1，表1。

2.2 CD133在卵巢癌和正常卵巢上皮中的表達(dá)CD13在EOC細(xì)胞漿內(nèi)有棕黃色均勻顆粒染色，蛋白陽(yáng)性表達(dá)率分別為68.4%，而正常卵巢組織中的表達(dá)率為31.6%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)圖1，表1。

2.3 HE4在卵巢癌中的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系HE4表達(dá)與年齡、腫瘤病理類型無(wú)關(guān)(P＞0.05)。HE4的表達(dá)與臨床分期、組織分化程度、絕經(jīng)狀態(tài)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P＜0.05)，即在臨床晚期、低分化組、絕經(jīng)組及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組HE4的蛋白陽(yáng)性表達(dá)率分別為84.2%、92.3%、91.4%和83.3%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表2。

圖1 卵巢癌組織中HE4和CD133的陽(yáng)性表達(dá)(免疫組化染色×400)A HE4在正常卵巢癌組織中的表達(dá);B HE4在EOC組織中的表達(dá);C CD133在正常卵巢癌組織中的表達(dá);D CD133在EOC組織中的表達(dá)

表1 兩種組織中HE4和CD133的陽(yáng)性表達(dá)率 例(%)

2.4 CD133在卵巢癌中的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 腫瘤上皮標(biāo)記物CD133的表達(dá)水平和EOC臨床病理各參數(shù)的關(guān)系與HE4基本一致，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。見(jiàn)表2。

表2 HE4及CD133與EOC臨床病理特征的關(guān)系 例(%)

2.5 HE4和CD133在上皮性卵巢癌組織中的相關(guān)性分析 57例上皮性卵巢癌中HE4與CD133均陽(yáng)性表達(dá)者29例，均陰性表達(dá)者11例，12例HE4表達(dá)陽(yáng)性而CD133陰性表達(dá)，5例HE4表達(dá)陰性而CD133陽(yáng)性表達(dá);兩者卵巢癌中的蛋白表達(dá)強(qiáng)度呈正相關(guān)(r=0.340，P=0.006)。見(jiàn)表3。

3 討論

卵巢癌發(fā)病隱蔽，在女性生殖腫瘤中的死亡率占第一位，它從早期癥狀到被確診癌細(xì)胞多數(shù)已擴(kuò)散，而晚期腫瘤治療效果一般很差，其5年生存率極低。EOC在卵巢惡性腫瘤最多見(jiàn)［7］，因此我們就 EOC中相關(guān)蛋白分子的表達(dá)情況做此研究。

表3 EOC組織中HE4及CD133表達(dá)的相關(guān)性分析 例

HE4最早被發(fā)現(xiàn)于人類的附睪上皮細(xì)胞中，在女性正常生殖道上皮也有一定表達(dá)，基因WFDC2位于染色體20q12-13.1上，編碼分子量約25 kD的小分子分泌性糖蛋白。HE4具有抗蛋白酶活性并可能參與精子成熟。研究顯示卵巢癌標(biāo)志物HE4在人類多種惡性腫瘤組織包括肺癌、乳腺癌、宮頸癌等均有較高表達(dá)［8］。但在卵巢癌中表達(dá)尤為明顯，約93%的漿液性上皮性卵巢癌表達(dá)HE4蛋白。本研究表明HE4陽(yáng)性表達(dá)率在臨床晚期，低分化癌及全身淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的EOC組織中增高，說(shuō)明HE4與腫瘤的惡性程度相關(guān)。絕經(jīng)組表達(dá)高于未絕經(jīng)組，說(shuō)明絕經(jīng)引起的激素或微環(huán)境的改變可能對(duì)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲有利。本研究發(fā)現(xiàn)HE4表達(dá)與病理類型無(wú)關(guān)，與相關(guān)研究［9］不一致，可能我們分類太籠統(tǒng)，簡(jiǎn)單分為漿液型卵巢癌和非漿液性卵巢癌，而后者HE4表達(dá)陽(yáng)性高的子宮內(nèi)膜樣卵巢癌組織標(biāo)本較多。

120 kDa的跨膜糖蛋白CD133最早發(fā)現(xiàn)于造血干細(xì)胞和神經(jīng)上皮干細(xì)胞表面，參與正常細(xì)胞膜形成過(guò)程。CD133在多種腫瘤中被發(fā)現(xiàn)，與腫瘤的惡性表型、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移能力有關(guān)［10］。我們發(fā)現(xiàn)隨著卵巢癌組織分化程度降低、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移增高，CD+133腫瘤細(xì)胞比率也明顯增高，說(shuō)明它與卵巢癌的惡化程度呈正相關(guān)。這與HE4在上皮性卵巢癌中的研究類似，提示二者在卵巢癌的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要的作用。

本研究發(fā)現(xiàn)HE4和CD133蛋白在卵巢癌和正常卵巢組織中均有表達(dá)，且癌癥組明顯高于正常組，這與目前相關(guān)研究結(jié)果一致。另外上皮性卵巢癌組織中HE4和CD133與卵巢癌病變程度有明顯相關(guān)性，且二者表達(dá)呈正相關(guān)。CD+133癌細(xì)胞上高表達(dá)HE4可能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞向淋巴結(jié)的侵襲，進(jìn)而加快腫瘤的全身轉(zhuǎn)移。尤其是卵巢癌患者的絕經(jīng)狀態(tài)與HE4和CD133表達(dá)均有關(guān)，這可能因?yàn)榻^經(jīng)期的女性免疫功能、內(nèi)分泌、遺傳、精神因素均有所改變［11］。我們認(rèn)為聯(lián)合檢測(cè)HE4和CD133利于闡明卵巢腫瘤發(fā)生發(fā)展、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移等腫瘤生物行為學(xué)規(guī)律，為上皮性卵巢癌早期診斷和惡性程度、預(yù)后轉(zhuǎn)歸提供參考依據(jù)。

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Expression and clinical significance of TH4 and CD133 in epithelial ovarian cancer

LU Dongmei，YANG Junhong．Department of Gynaecology and Obstetrics，Tangshan Institute for Maternal and Child Health，Hebei，Tangshan 063000，China

Objective To explore the expression and clinical significance of HE4 and CD133 in epithelial ovarian cancer(EOC).Methods The expression levels of HE4 and CD133 protein were detected in 57 cases of EOC tissues(EOC group)and 19 cases of normal ovarian tissues(control group)by immunohistochemistry.The correlation between the expressions of TH4，CD133 and clinicopathological parameters was analyzed.Results The positive expression rates of HE4 in control group and in EOC group were 42.1%(8/19)，71.9%(41/57)，respectively，and the positive expression rates of CD133 in the two groups were 31.6%(6/19)，68.4%(34/57)，respectively，there were significant differences between two groups(P ＜0.05).The expressions of HE4 and CD133 were closely correlated to clinical pathological staging，histodifferentiation degree，menopausal state，lymph node metastasis(P ＜0.05).Spearman correlation analysis showed that the expression of HE4 was closely related to that of CD133(r=0.340，P ＜0.01).Conclusion The overexpression of HE4 and CD133 protein may be correlated to the pathogenesis and development of EOC.

epithelial ovarian cancer;HE4;CD133;immunohistochemistry

R 737.31

A

1002-7386(2015)23-3538-03

10．3969/j．issn．1002-7386．2015．23．005

063000 河北省唐山市婦幼保健院婦產(chǎn)科

2015-01-20)