馬麗秀 韓福勝 李月光 屈超 劉桂蓮

尿素酶在眼組織中的表達及淚膜尿素減少與干眼癥的關(guān)系分析

馬麗秀 韓福勝 李月光 屈超 劉桂蓮

目的 探討尿素酶在淚腺和眼表組織表達，尿素是組成淚膜重要組成成分。方法 選取2011年3月至2013年3月20例干眼癥患者，58例正?；颊摺Ｍㄟ^RT-PCR和免疫組化染色測定淚腺和眼表組織尿素酶(精氨酸酶-1，2和鯡精胺酶)表達。共收集38例眼淚、房水、血清樣本。結(jié)果 精氨酸酶-1，2和鯡精胺酶在所有眼組織表達，除精氨酸酶-1在角膜無表達。眼淚尿素濃度與房水和血清尿素濃度無相關(guān)性(r=0.13，P=0.58;r=0.45，P=0.05)，房水尿素濃度與血清尿素濃度具有明顯相關(guān)性(r=0.7，P=0.0001)。干眼癥眼淚尿素濃度明顯低于正常對照組(P＜0.0001)。結(jié)論 眼淚中尿素酶能夠獨自生成尿素，使尿素濃度維持淚膜結(jié)果具有重要作用。

干眼癥;尿素酶;免疫組化;PCR

任何疾病和損傷累及眼淚分泌功能均能使淚膜不穩(wěn)定最終導致干眼癥。干眼癥發(fā)病是從輕微眼睛不適到嚴重視力障礙和角膜潰瘍漸進的過程。從流行病學顯示，干眼癥是一種常見病，尤其好發(fā)于老年人群，45歲以上患者發(fā)病率在20%［1］。雖然干眼癥可能因眼淚房水不足引起(房水不足干眼癥)，但最有可能是眼淚過度分泌有關(guān)(蒸發(fā)性干眼癥)［2］。眼板腺功能障礙即彌漫性異常，被認為是干眼癥最常見病因，也可能是無臨床表現(xiàn)眼瞼感染，目前對干眼癥治療方法較多，如人工眼淚，微脂肪噴霧劑，這些治療方法主要阻止角膜和結(jié)膜脫水和減輕患者臨床表現(xiàn)。慢性腎衰和糖尿病可能與干眼癥治病條件有關(guān)，常伴有血清尿素的變化［3］。尿素在眼淚中作用，到目前為止研究較少。在眼淚中，尿素有助于淚膜脂質(zhì)雙重結(jié)構(gòu)形成。本文通過測定正常人和干眼癥患者眼淚、血清和房水中尿素濃度，進一步評估尿素在干眼癥患者中作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 連續(xù)性收集我院2011年3月至2014年3月干眼癥患者20例，正常健康體檢者58例。根據(jù)中國眼科協(xié)會指導方針對所有患者進行一般眼科學檢查。后詢問患者病史和填寫調(diào)查表。采用裂隙燈檢查眼前半段包括平行于瞼緣的結(jié)膜皺褶，眼透鏡識別、眼角泡沫覆蓋物形態(tài)學檢查、熒光染色觀察破裂膜時間、眼淚分泌試驗。對照組為無干眼癥癥狀、沒有使用人工眼淚、沒有滴用潤滑劑和潤濕劑，除白內(nèi)障和屈光不正，無其他疾病。干眼癥組通過眼科醫(yī)師確診為中度干眼癥患者(非干燥綜合征)，且病史≥6個月及臨床表現(xiàn)如燒灼痛、刺痛、視力模糊等≥3個月，另一方面，患有代謝性疾病和自身免疫性疾病(干燥綜合征)排除研究。眼淚分泌試驗采用細管收集眼淚，后離心，樣本儲存4℃，直到進行下一步檢查。見表1。

表1 2組患者一般資料

1.2 方法

1.2.1 采集眼淚、血和房水標本:38例患者進一步收集眼淚、血和房水標本，其中男19例，女19例;平均年齡74歲，除年齡相關(guān)白內(nèi)障無其他眼疾病。使用27 g套管連接到一個注射器，由眼外科醫(yī)生穿刺獲得0.5～1.0 ml前方房水，在術(shù)前20～26 h收集同一個患者眼淚和血標本。

1.2.2 RNA制備和反轉(zhuǎn)錄DNA合成:使用傳統(tǒng)RTPCR技術(shù)，從8例活檢組織樣本淚腺、結(jié)膜和角膜在液態(tài)氮低溫下在瑪瑙研缽中呈細粉末狀，然后將5 ml RNA均勻地溶解在均質(zhì)器中。不能溶解物質(zhì)進行離心移除(12 000 g，5 min，4℃)。RNeasy-Kit盒分離出總RNA(北京美科美生物技術(shù)開發(fā)有限公司)，異丙醇純化RNA，酒精反復沉淀。通過RNase釋放DNase I除去污染DNA(20 min，25℃北京美科美生物技術(shù)開發(fā)有限公司)。DNase酶在65℃加熱15 min變性，RNA(500 ng)用于催化反應。應用50 ng/μl寡核苷酸15引發(fā)劑和(北京美科美生物技術(shù)開發(fā)有限公司)0.8 μl RNase H-逆轉(zhuǎn)錄酶(北京美科美生物技術(shù)開發(fā)有限公司)在37℃下60 min產(chǎn)生cDNA。

1.2.3 多聚酶鏈式反應(PCR):采用傳統(tǒng)PCR，所用患者 1 μl cDNA 應用 13.7 μl H2O、1 μl 50 mmol/L MgCl2、0.5 μl dNTP、2 μl 10 × PCR 緩沖液、0.3 μl(5 U)Taq DNA聚合酶(北京美科美生物技術(shù)開發(fā)有限公司)及以下下每種引發(fā)劑各0.5 μl(100 pmol):人類精氨酸酶類型Ⅰ(ARG1):NM-000045.2(正義:CTT AAA GAA CAAGAG TGT GAT，反義:TTC TTC CTA GTA GATAGCTGA;退火溫度58℃，產(chǎn)物550 bp)，人類精氨酸酶類型Ⅱ(ARG2):NM-00117.2(正義:GACACT GCC CAG ACC TTT GT，反義:CGT TCC ATGACC TTC TGG AT;退火溫度64℃，產(chǎn)物304 bp)，人類精胺脲水解酶 (鯡精胺酶)(AGMAT):NM-024758.4(正義:CAG CTG GGC TGTATT CCT CTG，反義:TAT CTG TAG GGA TCC AAGGTC G:退火溫度59℃，產(chǎn)物258 bp)進行孵化。

1.2.4 免疫組織化學和尿素濃度測定:應用免疫組化分析，甲醛固定淚腺上瞼結(jié)膜和角膜組織、石蠟包埋。將石蠟標本制成4 μm厚切片，常規(guī)二甲苯脫蠟。應用多克隆兔反-精氨酸酶Ⅰ(1∶100，北京美科美生物技術(shù)開發(fā)有限公司)和反-精氨酸酶Ⅱ(1∶100，北京美科美生物技術(shù)開發(fā)有限公司)，反-鯡精胺酶IgG(1∶100，Santa Cruz Biotechnology，USA)進行免疫組化染色。切片用胰島素預先處理5 min，切片浸入1∶5三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽水溶液中，用山羊血清孵育，以阻斷非特異性結(jié)合物。初級抗體室溫下孵育整夜，次級抗體反-兔IgG(1∶300，北京美科美生物技術(shù)開發(fā)有限公司)孵育孵育至少4 h。過氧化物酶標記的抗生蛋白鏈菌素-生物素和二氨基聯(lián)苯至少目測5 min。后用血補體復染，切片包埋。2個陰性對照組切片:一個僅用次級抗體孵育，另一個用初級抗體孵育。顯微鏡觀察載玻片。應用商業(yè)有效尿素/銨試劑盒(北京美科美生物技術(shù)開發(fā)有限公司)，根據(jù)操作說明檢查眼淚、學、和房水尿素濃度。簡單操作方法是尿素被尿素酶水解呈NH3和CO2。通過谷氨酸脫氫酶和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化使NH3和2-酮戊二酸生成L-谷氨酸。用吸收(光)譜法在340 nm測定煙酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化作用(北京美科美生物技術(shù)開發(fā)有限公司)。

1.3 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，計量資料以±s表示，采用t檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗，應用Pearson相關(guān)分析眼淚、血和房水尿素濃度的相關(guān)性，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 眼組織中尿素酶mRNA表達 測定尿素酶直接涉及到尿素生成。通過RT-PCR分析淚腺、結(jié)膜、角膜細胞和人類角膜上皮細胞，發(fā)現(xiàn)精氨酸酶Ⅰ在淚腺和結(jié)膜表達，在角膜細胞和和人類角膜上皮細胞無表達。精氨酸酶-Ⅱ中mRNA和鯡精胺酶在淚腺、結(jié)膜、角膜細胞和和人類角膜上皮細胞都有表達。見圖1。

圖1 尿素酶在眼組織中表達。通過RT-PCR分析尿素在淚腺(LG)、結(jié)膜(Co)、角膜細胞(Cj)和人類角膜上皮細胞(HCE)表達;NC、PC分別代表陰性和陽性表達

2.2 眼組織中精氨酸酶-Ⅰ、Ⅱ和鯡精胺酶蛋白表達應用免疫組化評估尿素酶在眼組織表達水平，精氨酸酶-1催化水解L-精氨酸生成L-鳥氨酸和尿素，尿素在人類腺泡細胞。結(jié)膜上皮細胞表達，但在角膜細胞無表達(角膜上皮、角膜細胞、內(nèi)皮細胞)。精氨酸酶-Ⅰ在人類上皮細胞無表達，然而精氨酸酶和鯡精胺酶蛋白在所有眼組織表達。精氨酸酶-2在淚腺腺泡細胞、結(jié)膜上皮細胞表達(杯狀細胞無表達)，而精氨酸酶-Ⅱ在角膜細胞和內(nèi)皮細胞無表達。精氨酸酶-2蛋白在人類上皮細胞細胞質(zhì)呈陽性表達。尿素酶在所有淚腺腺泡細胞無表達，僅有少量腺腺泡細胞發(fā)現(xiàn)尿素酶。鯡精胺酶蛋白在淚腺管上皮細胞中表達，在淚腺腺泡細胞無表達。在所有樣本檢查，鯡精胺酶在淚管上皮細胞質(zhì)內(nèi)表達，僅在上皮細胞表達。角膜細胞和內(nèi)皮細胞表達陰性。鯡精胺酶在人類角膜上皮細胞表達陽性。精氨酸酶Ⅱ和鯡精胺酶在淚腺、結(jié)膜和角膜表達，而精氨酸酶-Ⅰ僅在淚腺和結(jié)膜表達，且免疫組化結(jié)果和 PCR結(jié)果一樣。另外，精氨酸酶-脫羧酶mRNA在所有樣本表達。見圖2～4。

圖2 免疫組化顯示精氨酸酶-Ⅰ在淚腺和結(jié)膜表達;A精氨酸酶-Ⅰ在少淚腺腺泡細胞表達，B精氨酸酶-Ⅰ在結(jié)膜上皮細胞表達，C精氨酸酶-Ⅰ在角膜上皮細胞和基質(zhì)呈陰性表達，D精氨酸酶-Ⅰ不存在角膜及在人類角膜上皮細胞呈陰性表達

圖3 免疫組化顯示精氨酸酶-Ⅰ在淚腺、角膜和結(jié)膜表達;A精氨酸酶-Ⅱ在腺腺泡質(zhì)表達，B精氨酸酶-Ⅱ在結(jié)膜上皮細胞表達，C精氨酸酶-Ⅱ在角膜上皮細胞和基質(zhì)呈陰性表達，D精氨酸酶-Ⅱ角膜表達及在人類角膜上皮細胞呈陽性表達

圖4 免疫組化顯示鯡精胺酶在淚腺導管、角膜和結(jié)膜表達;A鯡精胺酶在腺腺泡細胞無表達，B鯡精胺酶在淚腺導管細胞表達，C鯡精胺酶在結(jié)膜上皮細胞表達，D角膜上皮細胞和基質(zhì)表達，E鯡精胺酶在角膜內(nèi)皮細胞表達，F(xiàn)鯡精胺酶在人類角膜上皮細胞呈陽性表達

2.3 白內(nèi)障手術(shù)患者尿素在眼淚、房水和血清中的濃度相關(guān)性分析 尿素在淚膜、房水和血清平均分別為(60.0 ± 25.9)mg/dl、(41.7 ± 19.9)mg/dl、(49.1 ±25.9)mg/dl。眼淚和房水尿素濃度無相關(guān)性(r=0.13，P=0.58)，眼淚和血清中尿素無相關(guān)性(r=0.45，P=0.05)。但房水和血清中尿素具有明顯相關(guān)性(r=0.7，P=0.0001)。

2.4 尿素在干眼癥患者眼淚中減少情況 檢測干眼癥患者和對照組眼淚中尿素濃度比較，干眼癥患者眼淚尿素濃度(27.8±8.6)mg/dl明顯低于健康對照組(42.0±12.8)mg/dl(P ＜0.01)。

3 討論

尿素是蛋白質(zhì)和氨基酸降解最終產(chǎn)物，從而半胱氨酸和L-精氨酸有重要作用。L-亮氨酸通過兩種途徑代謝為尿素，一為精氨酸通過精氨酸酶代謝為尿素和L-亮氨酸，另一為精氨酸脫羧酶代謝為胍基丁胺，然后通過鯡精胺酶轉(zhuǎn)化為四甲烯二胺和尿素［4］。精氨酸酶有兩組亞型:精氨酸酶-1和精氨酸酶-2，兩者催化同一化學反應。組織中缺乏其他鳥氨酸循環(huán)酶時精氨酸酶2表達［5］。相關(guān)文獻報道，尿素是鳥氨酸循環(huán)氮化合物產(chǎn)物，90%有腎臟排泄，其他有汗液或小腸排泄。尿素不僅是代謝廢物，而且能夠提供結(jié)合水的親水部分，確保細胞膜脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)。尿素本身沒有表面活性，然而通過表面結(jié)合蛋白影響分子表面［6］。尿素不足可能引起各種皮膚疾病。在細胞角化中，尿素是通過特殊氨基酸和部分精氨酸降解。某中角化狀態(tài)下，伴有精氨酸不足時，這樣使尿素濃度明顯減少，皮膚保留水分功能降低。已有研究發(fā)現(xiàn)尿素濃度與干皮膚有關(guān)，其尿素濃度低于正常人大約50%［7］。

許多疾病能夠增加尿素濃度如慢性腎功能衰竭和代謝性疾病常，它們與干眼癥疾病相關(guān)［8］。雖然在1930年知道尿素是淚膜組成成份，但沒有進一步研究尿素生理和病理功能，很少報道眼表尿素復合物是來自 L-精氨酸兩種不同酶途徑生成的［9］。Iyer等［10］確認人類鯡精胺酶，研究發(fā)現(xiàn)在不同人種和鼠類人類和鯡精胺酶mRNA和蛋白表達不同。本試驗檢測人類淚腺和眼表組織鯡精胺酶表達，同時顯示mRNA和蛋白表達水平。Farkas等［11］第一次在人眼淚檢測到精氨酸酶-1，2，但沒有報道這些酶在眼組織細胞中表達作用。本研究顯示淚腺腺泡細胞和結(jié)膜上皮細胞表達精氨酸酶-1，2。精氨酸酶-2也在角膜上皮表達。研究報道，精氨酸酶-1，2在鼠類角膜組織表達，但沒有敘述炎癥變化過程［12］。

這三種酶生成的尿素在傷口愈合、細胞生長代謝過程也起重要作用［13］。在前文尚未討論尿素在淚膜的作用。本研究檢測尿素在淚膜、房水、血清濃度，發(fā)現(xiàn)房水尿素濃度與血清尿素濃度具有相關(guān)性，然而淚膜與血清或房水尿素濃度無相關(guān)性。這表明淚膜尿素分泌獨立于血清尿素濃度?？赡苎蹨I和血液之間具有屏障，阻滯尿素通過，另外眼淚、房水和血液尿素濃度相似或他們之間相互作用。

腎功能不全疾病常伴有血液中尿素積累，可能導致屏障破壞，也可能代謝性疾病增加尿素轉(zhuǎn)運體表達，為了加速尿素毒物從人體排除。積累尿素可能從血液通過淚膜［14］。是否減少干眼癥淚膜中尿素含量，對淚膜穩(wěn)定性非常重要。然而在淚膜中尿素與皮膚中尿素功能相似。尿素可能形成淚膜和其他組織的脂質(zhì)層，然而淚膜脂質(zhì)層主要由瞼板腺組成，明顯不同于皮膚脂質(zhì)層，瞼板腺主要脂質(zhì)類型是由脂肪酸、脂肪醇、長鏈脂肪酸、酒精、膽固醇和其他少量脂類組成，尚不清楚磷脂是否瞼板腺組成成分［15］。然而，尿素在淚膜脂質(zhì)層形成具有重要作用，尿素能使組織細胞間脂質(zhì)具有親水性，形成膜狀結(jié)果。減少尿素濃度可能導致淚膜脂質(zhì)層分裂，表面張力減小，淚膜開始蛻變，導致干眼斑。增加尿素濃度如代謝性疾病或腎功能不全患者，可能導致表面活性減少［16］。通過結(jié)合表面活性蛋白如存在于淚膜活性蛋白B和C尿素能夠通過構(gòu)型變化特點改變表面活性蛋白結(jié)構(gòu)［17］。結(jié)果可能減少表面張力和淚膜開始破裂，導致干眼癥。

在代謝性疾病中，尿素彌漫性增加可能是通過改變尿素轉(zhuǎn)運體表達催化作用，引起尿素在眼淚中濃度增加，導致淚膜不穩(wěn)定。另一方面，如果無代謝性疾病，淚腺功能中缺乏尿素復合物可能導致眼淚尿素濃度減低，淚膜不穩(wěn)定。所以尿素穩(wěn)態(tài)對于淚膜物理化學性質(zhì)非常重要，必要平衡穩(wěn)定。眼淚尿素濃度是診斷干眼癥重要指標，同時加上其他診斷方法(眼淚分泌時間、淚膜破裂時間)更好確定干眼癥診斷。然而考慮到代謝性疾病能夠影響血清尿素濃度，評估在眼淚中增加尿素是治療干眼癥較為適合的方法。

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Expression of urease in ocular tissues and the correlation between the reduction of lacrimal film urea and xerophthalmia

MA Lixiu* ，HAN Fusheng，LI Yueguang，et al．*Department of Ophtalmology，Dachang Muslim PopulationAutonomous County，Hebei，Dachang 065300，China

Objective To investigate the expression of urea enzymes in lacrimal gland and ocular surface tissues，and urea is important component of lacrimal film.Methods Twenty patients with xerophthalmia from March 2011 to March 2013 were enrolled as observation group，and 58 healthy subjects were served as control group.The urease levels including arginase 1，2 and agmatinase in lacrimal gland and ocular surface tissues were detected by RT-PCR and immunohistochemistry.A total of 38 specimens were collected including tear fluid，aqueous humour and serum.Results The enzymes including arginase 1，2 and agmatinase were expressed in all the ocular tissues，except for arginase 1 without expression in cornea.The concentration of urea in tear fluid was not correlated to that in aqueous humour and serum(r=0.13，P ＞0.05;r=0.45，P=0.05)，however，the concentration of urea in aqueous humour was closely related with that in serum(r=0.7，P=0.01).The concentration of urea in observation group was significantly lower than that in control group(P＜0.01).Conclusion The urease in tear fluid can produce urea independently，which plays an important role in maintaining lacrimal film at a certain concentration of urea.

xerophthalmia;urease;immunohistochemistry;PCR

R 77

A

1002-7386(2015)23-3531-04

10．3969/j．issn．1002-7386．2015．23．003

065300 河北省大廠回族自治縣人民醫(yī)院眼科(馬麗秀)，骨科(韓福勝)，耳鼻喉科(李月光)，口腔科(屈超)，中醫(yī)科(劉桂蓮)

韓福勝，065300 河北省大廠回族自治縣人民醫(yī)院;E-mail:1150648151@qq.com

2015-06-10)