陸龍飛　葛勝祥　張　軍

化學發(fā)光免疫分析法研究進展

陸龍飛葛勝祥張軍★

［摘要］化學發(fā)光免疫分析法（chemiluminescence immunoassay，CLIA）是一種高靈敏度高特異性的檢測分析技術，具有廣泛的應用領域。本文簡要介紹了化學發(fā)光免疫分析法的分類、發(fā)展和應用，重點從實際應用的角度闡述了化學發(fā)光在解決低豐度低信噪比、多組分檢測、高速自動化等方面的發(fā)展情況，以及簡要介紹了新型材料、試劑和技術應用于化學發(fā)光體系的進展，并對化學發(fā)光免疫分析法的發(fā)展趨勢進行了展望。

［關鍵詞］化學發(fā)光免疫分析；多組分檢測；流動注射分析；量子點；微流控芯片

作者單位：廈門大學國家傳染病診斷試劑與疫苗工程技術研究中心，福建，廈門361102

Review on the development of chemiluminescence immunoassay

LU Longfei, GE Shengxiang, ZHANG Jun★
(National Institute of Diagnostics and Vaccine Development in Infectious Diseases, Xiamen University，Xiamen, Fujian, China, 361102)

[ABSTRACT] Chemiluminescence immunoassay (CLIA) was a widely used technology attribute to its high sensitivity and specificity. The classification, recent advances and the application of chemiluminescence immunoassay were reviewed. This review was focused on the advances of chemiluminescence immunoassay in practical application, especially in improving the signal-to-noise ratio of low abundance samples, multianalyte detection, rapid and automatic detection. In addition, the advances of new materials, reagents and technologies applied in chemiluminescence immunoassay were briefly reviewed．And the development trend of chemiluminescence immunoassay was prospected.

[KEY WORDS] Chemiluminescence immunoassay; Multi-analyte detection; Flow injection analysis; Quantum dot; Microfluidics

1978年Halman等成功建立化學發(fā)光免疫分析法（chemiluminescence immunoassay，CLIA）以來，該方法大致經(jīng)歷了4個階段的發(fā)展［1］，相繼應用了大量新的材料、技術、工藝和儀器而日趨完善和普及?；瘜W發(fā)光免疫分析法是將具有高靈敏度的化學發(fā)光測定技術與高特異性的免疫反應相結合的檢測分析技術，通過激發(fā)化學發(fā)光劑進入激發(fā)態(tài)再回到穩(wěn)定態(tài)并發(fā)射光子的過程，將免疫反應信號轉化為光信號，進而利用光信號測量儀器測定發(fā)光強度，發(fā)光強度因與待測物質濃度在一定條件下呈線性定量關系，從而確定待測物質濃度。

1　化學發(fā)光免疫分析的分類

根據(jù)化學發(fā)光所用的標記物和發(fā)光原理的不同，一般可分為3類：直接化學發(fā)光免疫分析、酶促化學發(fā)光免疫分析和電化學發(fā)光免疫分析。不同于前兩者，電化學發(fā)光由電啟動電極表面的電化學發(fā)光劑發(fā)生電化學反應產(chǎn)生光信號，常需要共反應劑提高發(fā)光效率，如三丙胺（tripropylamine，TPA）作為三聯(lián)吡啶釕（［Rb（bpy）3］2＋）的電子供體共反應劑。常用的發(fā)光體系有：吖啶酯類、魯米諾類（luminol）、三聯(lián)吡啶釕類、過氧化草酸酯類（TCPO、DNPO）和強氧化劑高錳酸鉀、Ce（SO4）2等（見表1）。有些發(fā)光劑與氧化劑反應緩慢，還需要催化劑和增強劑的作用，提高發(fā)光強度和穩(wěn)定性。

表1　化學發(fā)光免疫分析的分類和常用體系Table 1 Classification of chemiluminescence immunoassay and systems in common use

2　化學發(fā)光免疫分析的發(fā)展方向

近年來，隨著化學發(fā)光免疫分析在各個領域的應用，對其各方面要求和需求也發(fā)生了改變，在應用了大量新技術、新材料的基礎上，化學發(fā)光免疫分析法呈現(xiàn)出高靈敏度、高通量和自動化的發(fā)展趨勢。

2．1高靈敏度檢測

實際應用中常涉及到樣品豐度低、信噪比低、穩(wěn)定性差和信號干擾等的問題。為解決化學發(fā)光免疫分析的實用性，需要提高其靈敏度和穩(wěn)定性：一方面降低信號噪音，減少非特異性反應信號和信號干擾；另一方面增強光信號，提高信噪比和穩(wěn)定性。

化學發(fā)光免疫分析系統(tǒng)的信號噪音和信號干擾的因素主要是發(fā)光體系缺陷和原料試劑特異性的影響。為改善發(fā)光體系缺陷，研發(fā)新的發(fā)光劑、增強劑、發(fā)光體系等［5，9］以及對于反應時間、孵育時間、緩沖液的選擇和標記抗體濃度等細節(jié)進行優(yōu)化［10－11］，都是減少信號噪音干擾的影響因素，也是人們長期研究的目標。原料試劑中，基因工程抗原由于表達系統(tǒng)、標簽融合蛋白的不同而導致修飾折疊的差異，往往對重組抗原的特異性和靈敏度帶來很大影響。單克隆抗體（monoclonal antibody，Mab）具有很強的免疫反應特異性，圍繞Mab的改造，減少無關結構，提高特異性和活性的研究日益增多，如嵌合抗體、小分子抗體、噬菌體抗體和胞內(nèi)抗體等。因此，如何表達篩選獲得高特異性和高靈敏度的抗原抗體［12－13］成為人們研究的重點之一。此外采用多種重組抗原或抗體聯(lián)檢［14－15］往往也能起到很好的效果。

除了減少信噪和干擾外，如何增強發(fā)光信號提高穩(wěn)定性一直是化學發(fā)光研究的重點，新型納米材料如納米金、碳納米管CNT、碳納米球CNSs、碳納米纖維以及量子點等聯(lián)用到CLIA中，大大提高了CLIA的信號強度和穩(wěn)定性。電化學發(fā)光免疫分析中電極表面是電化學反應的關鍵場所，電極表面的修飾對于電化學發(fā)光具有重要作用，對此人們開展了大量電極修飾的研究，特別是新型納米材料、表面活性劑等［6－8］對于電化學發(fā)光影響的研究。近些年，透明電極如氧化銦錫（indium tinoxide，ITO）電極與光導纖維技術的結合減少了干擾且更為簡便，具有很好的應用前景。Chen［6］用覆蓋了一層含氟表面活性劑的4 nm的金納米顆粒（GNPs）去修飾ITO電極，形成了FSO-GNP-ITO修飾電極，大大改善了ITO電極用于ECLIA時TPA氧化率低和ITO表面不穩(wěn)定的問題，提高了發(fā)光的穩(wěn)定性和靈敏度。

量子點QDs具有尺寸可調(diào)的光學特性和高熒光量子產(chǎn)率，是生物熒光標記物的理想光學材料。但是量子點化學發(fā)光也存在著自身的缺點，比如QDs-ECL需要高發(fā)光電位，發(fā)光強度低等問題。通過改造量子點比如核殼結構量子點、摻雜型量子點和單質量子點等［16－18］，修飾和改善QDs-ECL體系的發(fā)光信號強度和靈敏度，取得了很好的效果。Guo等［19］建立了一個表面用石墨烯（G）-CdS QDs-瓊脂糖復合材料修飾的玻璃碳電極（glass carbon electrode，GCE）的CdS QDs-ECL系統(tǒng)，以戊二醛（glutaric dialdehyde，GLD）為交聯(lián)劑結合抗體，檢測甲種胎兒球蛋白，石墨烯能大大提高CdS QDs-ECL的檢測下限和靈敏度。

2．2多項目聯(lián)合檢測

在臨床應用中，常常需要對復雜體系的未知樣本進行多組分的測定或者多種指標的檢測，實現(xiàn)對于多組分的檢測可以大大提高檢測分析的準確性和可靠性，減少檢測分析時間和繁瑣的人工操作，是免疫分析研究的一個重要方向。一般靜態(tài)多組分同時檢測主要有2種模式：多標記物分辨技術和空間分辨技術。

多標記物分辨技術以不同的標記物標記不同的免疫活性物質，再通過識別不同的標記信號來檢測不同的組分。Qian［20］以兔免疫球蛋白抗原（IgG）和癌胚抗原（carcino-embryonic，CEA）為模型蛋白，將水溶性量子點材料CdS和PbS分別包裹到SiO2納米顆粒上作為探針標記到IgG和CEA抗體上，形成”三明治”探針Si／Cd／anti-IgG 和Si／Pb／anti-CEA，經(jīng)夾心法免疫反應后，再以方波伏安法（square wave voltammetry，SWV）在-0．57V和－0．81V電壓下分別檢測探針信號，實現(xiàn)了多標記物的同時檢測。多色量子點用于CLIA的多組分檢測是另外一種形式的“多標記物”分辨技術，多色熒光探針具有一元激發(fā)多元發(fā)射的優(yōu)點，能同時標記和跟蹤多個生物分子事件。Goldman等［21］構建了ZnS-CdSe核殼結構的多色量子點標記抗體，用夾心免疫法在4種不同波長下檢測4種毒素的混合物，顯示多色量子點能夠完成一般有機染料難以完成的同時多組分檢測。但是由于多種信號的重疊交叉干擾，多標記物模式不可避免地涉及到最優(yōu)分析的妥協(xié)。

空間分辨技術是通過在不同的區(qū)域空間發(fā)生免疫反應，再利用陣列檢測器光電倍增管（photomultiplier tube，PMT）、電荷耦合元件（charge-coupled device，CCD）等同時測定大量樣品。Fu［22］設計的雙通道流通池，通道Ⅰ標記腫瘤標志物CA153 和CA125抗體，通道Ⅱ標記CA199和CEA抗體，同時檢測4種腫瘤標志物（圖1）。其將堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）和辣根過氧化物（horseradish peroxidase，HRP）標記到2個通道的抗體上，再向兩個通道分別加入相應的底物發(fā)光劑（S1和S2）催化兩個通道的化學發(fā)光（chemiluminescence，CL）反應。當用光電倍增管PMT收集其中一個信號時，采取移動光柵來遮蔽其他通道進行收集。

圖1　通道底物二維空間分辨化學發(fā)光免疫分析系統(tǒng)［22］Figure 1 Channel and substrate zone two-dimensional resolution system for CLIA［22］

傳統(tǒng)的靜態(tài)檢測方法耗時較多，流動注射分析（flow injection analysis，F(xiàn)IA）結合化學發(fā)光系統(tǒng)形成的動態(tài)檢測方法具有靈敏度高、分析速度快、重復性好和在線自動分析的優(yōu)點，順序注射分析作為FIA分析的一個重要分支還可以實現(xiàn)多組分的在線過程分析和同時檢測［23－24］。一些具有高效分離檢測能力的技術也可以與化學發(fā)光結合，如高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）、毛細管電泳法（capillary electrophoresis-chemiluminescence，CE）和微流控芯片（micro-fluidic chip，MFC）［25－28］，形成高自動化水平和高分離能力，快速、靈敏的在線多組分分離免疫分析檢測法。當然聯(lián)用體系也存在著自身的缺點，需要優(yōu)化檢測條件和接口類型等。Huang等［26］構建了微型化的FIA-CE-ECL裝置中（圖2），采用落滴型分流接口來解決FIA分流進樣與CE的隔離，［Rb（bpy）3］2＋以流動的方式不斷加入柱端檢測區(qū)域，將毛細管尾端插入到［Rb（bpy）3］2＋流動池中實現(xiàn)［Rb（bpy）3］2＋在毛細管出口端的電化學發(fā)光反應，再通過光纖經(jīng)PMT檢測。通過優(yōu)化毛細管出口和工作電極、光纖的相對位置獲得很高的靈敏度和分離效率。在68 mm長的分離毛細管中，脯氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸在180 s內(nèi)得到分離檢測。

微流控芯片分析技術結合了CLIA、CE、FIA和微流控的技術和優(yōu)勢，具有分析速度快、試劑消耗少和高度自動化等特點，包括非均相免疫反應和均相免疫反應2種反應方式。非均相免疫反應因具有富集效應而擁有更高的靈敏度［29］，而均相免疫反應具有更高的分離效率和更短的反應時間，但是由于在線引入發(fā)光劑對其他通道的干擾以及與發(fā)光劑混合效率較低等因素［27］，實際應用還存在許多問題。Zhao［28］在微芯片電泳系統(tǒng)上完成細胞注入加載、溶解、電泳分離和發(fā)光檢測，通過luminol-Na2S2O8體系選擇性地檢測細胞內(nèi)的巰基化合物Cys、GSH和血紅蛋白Hb，在120 s內(nèi)完成分離，檢測下限分別達到1 amol、32 amol、69 amol。雖然微流控芯片與傳統(tǒng)CE相比靈敏度還不夠理想，但是未來微型化、自動化、集成化和便攜化是分析儀器設備發(fā)展趨勢，微流控分析芯片作為微全分析系統(tǒng)的重要組成部分之一，還是具有很大的改進空間和應用前景。

圖2　微型流動注射毛細管電泳電化學發(fā)光檢測系統(tǒng)［26］Figure 2　Miniaturized capillary electrophoresis system with flow injection sample introduction and electrogenerated chemiluminescence detection［26］

2．3全自動化檢測

傳統(tǒng)的免疫分析由于免疫物質的混合反應效率低，檢測分析的流程冗長操作繁瑣，因而耗時較多。為實現(xiàn)快速檢測，需加速熱力和免疫動力學反應，提高自動化水平，聯(lián)用其他技術減少操作節(jié)約時間。磁性納米微粒作為載體平臺，不但可以提高混合和反應效率以及靈敏度，利用外加磁場還可以方便快捷的分離結合相，減少繁瑣的人工操作，為CLIA的全自動化發(fā)展奠定了堅實的基礎。Zhang等［30］利用磁微粒（magnetic particles，MP）和包被管的化學發(fā)光酶免疫分析法（chemiluminescent enzyme immunoassay，CLEIA）對人血清甲種胎兒球蛋白的評估和分析進行了研究比較，MP-CLEIA的線性范圍更廣泛、分析時間更短、鉤狀效應濃度更高，顯示MP-CLEIA對于篩查檢測的方便快捷優(yōu)越的優(yōu)點和全自動化操作系統(tǒng)的應用潛力。

隨著人們對于檢測水平和儀器要求的提高，化學發(fā)光免疫分析提高靈敏度、穩(wěn)定性、檢測項目以及分析速度等，集成磁微粒、流動注射分析、微流控芯片以及機械電子等的新型自動化材料技術形成智能化、自動化、一體化系統(tǒng)是大勢所趨。未來更高通量的全自動化學發(fā)光分析儀器、即時檢測［31］儀器、遠程在線檢測儀器等將成為相關的研究熱點之一。表2概述了目前市場上國內(nèi)外代表性全自動化學發(fā)光免疫分析體系。

3　化學發(fā)光的應用與展望

鑒于化學發(fā)光免疫分析法高靈敏度、寬線性范圍、分析速度快等優(yōu)點，雅培、羅氏、貝克曼等相繼推出了全自動檢測儀器，極大地提高了工作效率和檢測的準確度靈敏度，減少人為操作誤差，推動了化學發(fā)光免疫分析法在臨床、食品安全和環(huán)境分析等方面的應用。目前在臨床上主要應用于激素、腫瘤標志物、心肌標志物、傳染病等［32－33］的檢測，為了提高診斷準確性，減少漏檢等誤差，結合多種抗原抗體聯(lián)檢取得了良好的效果。第四代雅培的艾滋病毒化學發(fā)光檢測試劑盒，采用艾滋病毒的P24抗原和HIVI／HIVII型抗體聯(lián)檢，大大提高了檢測的準確度和靈敏度，有效的減少了漏檢的發(fā)生。

自從20世紀60年代開始，現(xiàn)代電子技術和高靈敏度的光電傳感器的發(fā)展，提供了許多研究和測定化學發(fā)光的新手段，對該領域的發(fā)展起到了極大的推動作用而迅速發(fā)展。近年來，化學發(fā)光的發(fā)展主要表現(xiàn)在：（1）化學發(fā)光使用的試劑以及原料的制備標記等研究和發(fā)展；（2）新化學發(fā)光體系和條件的不斷建立和優(yōu)化；（3）新型納米材料與化學發(fā)光的結合應用；（4）化學發(fā)光與其他方法或技術聯(lián)用，包括流動注射技術、新傳感器技術、毛細管電泳分離技術和微流控技術等等，拓寬了化學發(fā)光體系的應用范圍；（5）化學發(fā)光儀器的研究開發(fā)，為化學發(fā)光的進一步發(fā)展創(chuàng)造條件；（6）化學發(fā)光分析的應用范圍擴大至各個領域。因此，可以預見，化學發(fā)光免疫分析法將更多的聯(lián)用其他技術和材料，提高靈敏度和穩(wěn)定性，逐步完善自動化、集成化、微型化、智能化和便攜性水平，特別是發(fā)展多組分的全自動快速檢測儀器和POCT儀器，應用到更廣泛的領域范圍。

表2　常見的化學發(fā)光免疫分析儀器技術參數(shù)Table 2 Technical parameters of common chemiluminescence immunoassay instruments

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·論著·

通訊作者：★張軍，E-mail：zhangj＠xmu．edu．cn

基金項目：國家高技術研究發(fā)展計劃（863計劃）（2011AA02A101）