陳鷺?lè)f　林海軍　翁祖星　徐飛?！「饎傧椤垺≤姟?/p>

基于全自動(dòng)管式化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)系統(tǒng)的人結(jié)核感染T細(xì)胞檢測(cè)方法的建立

陳鷺?lè)f1林海軍2翁祖星2徐飛海2葛勝祥2張軍2★

［摘要］目的建立基于化學(xué)發(fā)光平臺(tái)的人結(jié)核感染T細(xì)胞檢測(cè)方法。方法將一株γ－干擾素單抗標(biāo)記在磁微粒上，另一株γ－干擾素單抗標(biāo)記在吖啶酯上，然后將檢測(cè)體系與已有的細(xì)胞刺激培養(yǎng)體系相結(jié)合。結(jié)果本研究成功建立基于化學(xué)發(fā)光平臺(tái)的人結(jié)核感染T細(xì)胞檢測(cè)方法。以ELISA平臺(tái)檢測(cè)試劑的檢測(cè)結(jié)果作為參考，該方法的靈敏度為98．3%，特異性為99．2%，總體符合率達(dá)到98．8%。結(jié)論該方法具有更高的分析靈敏度（可達(dá)0．27 pg／mL）、更寬的線性范圍（1 pg／mL～5 000 pg／mL）、更好的重復(fù)性（批內(nèi)與批間變異系數(shù)均＜6．0%）及更易實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)，為臨床診斷結(jié)核感染提供了有力的工具。

［關(guān)鍵詞］結(jié)核感染T細(xì)胞；γ-干擾素定量檢測(cè)；化學(xué)發(fā)光

作者單位：1．福建省食品藥品認(rèn)證審評(píng)中心，福建，福州350003 2．廈門大學(xué)國(guó)家傳染病診斷試劑與疫苗工程技術(shù)研究中心，福建，廈門361102

Development of detection kit for T cell infected with Mycobacterium tuberculosis based on fullautomatic chemiluminescence immune analyzer

CHEN Luying1, LIN Haijun2, WENG Zuxing2, XU Feihai2, GE Shengxiang2, ZHANG Jun2★
(1. Fujian Food and Drug Administration, Fuzhou, Fujian, China, 350003; 2. National Institute of Diagnostics and Vaccine Development in Infectious Diseases, Xiamen University, Xiamen, Fujian, China, 361012)

[ABSTRACT] ObjectiveTo develop the detection kit for T cell infected with Mycobacterium tuberculosis based on full-automatic chemiluminescence immune analyzer. Mehtods An antiIFN-γ Mab was coated on the surface of microparticle. Another anti IFN-γ Mab was labelled to acridinium ester. After that, the detection system was combined with the in vitro cell culture system.ResultsThis research developed the detection kit for T cell infected with Mycobacterium tuberculosis based on full-automatic chemiluminescence immune analyzer. Compared with the testing results of the ELISA kit, the sensitivity, specificity and total matching ratio of the CLIA kit was 98.3%, 99.2% and 98.8%, respectively. ConclusionThe CLIA kit has better sensitivity (0.27 pg/mL), wilder linear range (1 pg/mL ～ 5 000 pg/mL), and better repeatability (intra and inter coefficient of variation < 6.0%). It makes a high throughput detection available. It will contribute to the clinical diagnosis of Mycobacterium tuberculosis.

[KEY WORDS] T cell infected with Mycobacterium tuberculosis; IFN-γ quantitative detection; Chemiluminescent immunoassay

目前全球約有三分之一的人感染了結(jié)核分枝桿菌，其中約10%會(huì)進(jìn)一步發(fā)展成為活動(dòng)性結(jié)核［1］。臨床上用于判斷結(jié)核分枝桿菌感染的最常見(jiàn)方法是結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)（tuberculin skin test，TST）。但TST的特異性較差，陽(yáng)性結(jié)果不能排除非結(jié)核分枝桿菌（Nontuberculous mycobacteria，NTM）感染，也無(wú)法區(qū)分是否由接種卡介苗引起［1－2］。因此，近年來(lái)在歐美發(fā)達(dá)國(guó)家，TST已逐漸被γ-干擾素釋放試驗(yàn)（interferon gamma release assay，IGRA）所取代。IGRA的方法是利用結(jié)核分枝桿菌特異性抗原與受試者的新鮮外周全血中的T細(xì)胞共同孵育刺激培養(yǎng)，如果受試者受到過(guò)結(jié)核分枝桿菌感染，那么激活的T細(xì)胞會(huì)分泌大量的γ-干擾素，通過(guò)γ-干擾素的定量檢測(cè)可以判斷受試者是否存在結(jié)核菌感染。由于IGRA采用結(jié)核分枝桿菌特異性抗原（CFP-10和ESAT-6）作為刺激原，不受卡介苗和一些非結(jié)核分枝桿菌的影響，其判斷結(jié)核感染特異性明顯高于TST試驗(yàn)［3－6］。目前國(guó)內(nèi)已上市的IGRA產(chǎn)品主要分為2類，一類為酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法（enzyme-linked Immunospot，ELISPOT），代表試劑為英國(guó)Oxford Immnnotec 的T-SPOT．TB試劑；另一類為體外釋放酶聯(lián)免疫法（tuberculosis interferon gamma release assay，TB-IGRA），代表試劑為澳大利亞Cellestis公司的QFT-GIT試劑和北京萬(wàn)泰的TB-IGRA試劑。ELISPOT方法直接測(cè)量外周血中MTB特異T細(xì)胞的含量，但需進(jìn)行淋巴細(xì)胞分離培養(yǎng)和ELISPOT斑點(diǎn)計(jì)數(shù)，其技術(shù)水平和實(shí)驗(yàn)室條件要求較高，在我國(guó)僅能在部分科研單位及大的中心實(shí)驗(yàn)室使用。TB-IGRA方法通過(guò)檢測(cè)T細(xì)胞在體外抗原刺激后的IFN-γ釋放來(lái)間接檢測(cè)機(jī)體特異性T細(xì)胞應(yīng)答。該技術(shù)采用全血培養(yǎng)，僅需普通37℃溫箱和實(shí)驗(yàn)室常規(guī)的檢測(cè)儀器，便于在有一定條件的醫(yī)療單位推廣使用。目前采用TB-IGRA方法的試劑在γ-干擾素檢測(cè)部分均采用傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫分析，而化學(xué)發(fā)光免疫分析與傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫分析相比，它具有更高的靈敏度、更寬的線性范圍、更好的重復(fù)性及更容易實(shí)現(xiàn)高通量的檢測(cè)［7］。本研究基于TB-IGRA原理，采用化學(xué)發(fā)光免疫分析法［7－8］（chemiluminescent immunoassay，CLIA）建立γ-干擾素檢測(cè)體系，并結(jié)合已有的細(xì)胞刺激培養(yǎng)體系建立了人結(jié)核感染T細(xì)胞檢測(cè)方法，評(píng)價(jià)試劑各項(xiàng)性能指標(biāo)，在臨床檢測(cè)中與國(guó)產(chǎn)主流試劑進(jìn)行對(duì)比，其更寬檢測(cè)范圍等性能的實(shí)現(xiàn)，將為γ-干擾素釋放試驗(yàn)（interferon gamma release assay，IGRA）方法在結(jié)核病的輔助診斷以及用藥后的療效監(jiān)測(cè)等方面的深入研究與應(yīng)用提供有力的工具。

1　材料與方法

1．1材料和試劑

2株γ-干擾素單克隆抗體C6H4和8A11、γ-干擾素抗原、特異性刺激抗原E1CO和陽(yáng)性刺激抗原PHA均來(lái)自廈門大學(xué)；磁珠購(gòu)自Merck公司，吖啶酯原料來(lái)自廈門大學(xué)；檢測(cè)儀器CARIS200分析儀及其配套耗材來(lái)自廈門優(yōu)邁科醫(yī)學(xué)儀器有限公司；對(duì)照試劑盒采用北京萬(wàn)泰生物藥業(yè)股份有限公司的結(jié)核分枝桿菌相關(guān)γ-干擾素檢測(cè)試劑盒（體外釋放酶聯(lián)免疫法）。

用γ-干擾素抗原配制的參考品：L系列參考品（L1～L8，濃度分別為1 pg／mL、5 pg／mL、15 pg／mL、50 pg／mL、150 pg／mL、500 pg／mL、1 500 pg／mL、5 000 pg／mL）；精密度參考品CV-1（15 pg／mL）、CV-2（500 pg／mL）。臨床樣本來(lái)自廈門大學(xué)。

1．2方法

1．2．1磁珠包被單克隆抗體

取磁珠用EDC溶液（10 mg EDC溶于1mL去離子水）活化，然后加入單克隆抗體C6H4并置于旋轉(zhuǎn)混勻儀上孵育偶聯(lián)，孵育后用甘氨酸溶液（pH 7．4）進(jìn)行封閉，完成封閉后保存在含酪蛋白的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）中。

1．2．2吖啶酯標(biāo)記單克隆抗體

取單克隆抗體8A11稀釋到合適濃度后加入吖啶酯（溶于甲基甲酰胺中），混勻，室溫避光反應(yīng)；加入賴氨酸溶液（pH 8．0）封閉；最后透析到PBS中，用含酪蛋白的PBS稀釋后使用。

1．2．3刺激培養(yǎng)管的配制

直接在培養(yǎng)管中加入50 μL 50 mmol／L的PBS，作為本底對(duì)照培養(yǎng)管N。用50 mmol／L的PBS將特異性結(jié)核桿菌抗原E1C0稀釋至50 μg／mL，每根培養(yǎng)管中加入50 μL稀釋后的E1C0，作為測(cè)試培養(yǎng)管T。用50 mmol／L的PBS將陽(yáng)性抗原PHA稀釋至1 mg／mL，每根培養(yǎng)管中加入50 μL稀釋后的PHA，作為陽(yáng)性對(duì)照培養(yǎng)管P。

1．2．4參考品的配制

用20%嬰牛血清將γ-干擾素抗原稀釋成所需濃度，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1．2．5γ-干擾素的體外釋放

采集：每個(gè)受試者采用靜脈穿刺術(shù)采集標(biāo)本，使用肝素抗凝的真空采血管采集。分裝：在2 h之內(nèi)將采集的全血分裝到“本底對(duì)照培養(yǎng)管N”、“測(cè)試培養(yǎng)管T”、“陽(yáng)性對(duì)照培養(yǎng)管P”3個(gè)培養(yǎng)管中。每種培養(yǎng)管加入全血1．0 mL，分裝前需要將采集的全血標(biāo)本顛倒混勻3次以上。培養(yǎng)：將培養(yǎng)管輕柔顛倒5次后迅速放入37℃溫箱培養(yǎng)（22±2）h，培養(yǎng)過(guò)程中保持試驗(yàn)管直立。離心：將培養(yǎng)后的全血以3 000 r／min～5 000 r／min離心10 min，取血漿進(jìn)行檢測(cè)，注意不可吸到細(xì)胞層。

1．2．6γ-干擾素的測(cè)定

通過(guò)CARIS系統(tǒng)執(zhí)行測(cè)定操作：CARIS系統(tǒng)先吸取樣本轉(zhuǎn)移到反應(yīng)杯中；向反應(yīng)杯中加入包被后的磁珠，混勻、孵育并沖洗反應(yīng)混合物；向反應(yīng)杯中加入標(biāo)記后的吖啶酯，混勻、孵育并沖洗反應(yīng)混合物；添加預(yù)激發(fā)液和激發(fā)液后檢測(cè)反應(yīng)復(fù)合物的相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度（relative light unit，RLU）。

1．2．7四參數(shù)擬合劑量反應(yīng)曲線

1．2．8分析靈敏度的確定

用試劑檢測(cè)L系列參考品，用GraphPad Prism5．01進(jìn)行四參數(shù)擬合試劑劑量反應(yīng)曲線。然后重復(fù)測(cè)定基質(zhì)血清20次，計(jì)算其平均發(fā)光值、標(biāo)準(zhǔn)差（standard deviation，SD），得出M＋2SD，然后將M＋2SD的RLU值代入試劑盒劑量反應(yīng)曲線方程中，求出對(duì)應(yīng)的濃度值，即為其分析靈敏度。

1．2．9精密度的測(cè)量

用3批試劑分別檢測(cè)精密度參考品CV-1（15 pg／mL）、CV-2（500 pg／mL），每份標(biāo)本平行檢測(cè)10次，計(jì)算測(cè)定值的平均值和SD，按照公式CV＝SD／平均值×100%計(jì)算批內(nèi)和批間CV。

2　結(jié)果

2．1分析靈敏度

以L系列參考品建立四參數(shù)擬合試劑劑量反應(yīng)曲線，通過(guò)重復(fù)測(cè)定基質(zhì)血清得出所建立化學(xué)發(fā)光試劑的檢測(cè)下限（分析靈敏度）為0．27 pg／mL，而ELISA試劑盒的分析靈敏度為2 pg／mL。

2．2劑量反應(yīng)曲線

用試劑重復(fù)檢測(cè)4次L系列參考品，建立四參數(shù)擬合試劑劑量反應(yīng)曲線，測(cè)量值與標(biāo)定值的相關(guān)系數(shù)（r）為0．99997，表明本試劑具有良好的劑量反應(yīng)關(guān)系（圖1）。

圖1　試劑劑量反應(yīng)曲線Figure 1　Dose-response curve of the reagent

2．3精密度

用3批試劑分別檢測(cè)精密度參考品CV-1（15 pg／mL）、CV-2（500 pg／mL）。結(jié)果顯示3批試劑的批內(nèi)及批間精密度良好（表1）。

2．4抗干擾能力

分別考察溶血、黃疸、高脂、類風(fēng)濕因子（rheumatoid factor，RF）等不同干擾因素對(duì)試劑檢測(cè)結(jié)果的影響。

2．4．1溶血

選取3份臨床確診為肺結(jié)核的標(biāo)本（編號(hào)分別為1?！?＃），在進(jìn)行刺激培養(yǎng)前將采集的新鮮血分成2組，其中一組進(jìn)行正常刺激培養(yǎng)，另外一組進(jìn)行溶血處理后刺激培養(yǎng)，然后檢測(cè)每份標(biāo)本的γ-干擾素含量，從而對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行判定，結(jié)果如表2所示。

由表2可知，正常培養(yǎng)的3份標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，但溶血后對(duì)標(biāo)本進(jìn)行培養(yǎng)，陽(yáng)性對(duì)照管沒(méi)有反應(yīng)，結(jié)果判定為不確定，這可能是由于溶血標(biāo)本中T細(xì)胞破裂死亡導(dǎo)致。因此，溶血對(duì)本試劑檢測(cè)結(jié)果有較大影響，在標(biāo)本處理時(shí)應(yīng)避免溶血現(xiàn)象的出現(xiàn)。

表2　溶血對(duì)檢測(cè)的影響Table 2 The influence of hemolysis

2．4．2黃疸

選取3份臨床確診為肺結(jié)核和黃疸的標(biāo)本（編號(hào)分別為4?！?＃）、3份臨床確診為非結(jié)核但有黃疸的標(biāo)本（編號(hào)分別為7?！?＃）進(jìn)行培養(yǎng)，然后檢測(cè)每份標(biāo)本的γ-干擾素含量，從而對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行判定，結(jié)果如表3所示。

表3　黃疸對(duì)檢測(cè)的影響Table 3　The influence of jaundice

由表3可知，臨床確診為肺結(jié)核和黃疸的標(biāo)本用本試劑檢測(cè)均為陽(yáng)性，非結(jié)核但患有黃疸的標(biāo)本本試劑檢測(cè)均為陰性，表明黃疸不會(huì)對(duì)本試劑檢測(cè)結(jié)果造成影響。

2．4．3高脂

選取3份臨床確診為肺結(jié)核的高脂標(biāo)本（編號(hào)分別為10＃～12＃）、3份臨床確診為非結(jié)核的高脂標(biāo)本（編號(hào)分別為13?！?5＃）進(jìn)行培養(yǎng)，然后檢測(cè)每份標(biāo)本的γ-干擾素含量，從而對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行判定，結(jié)果如表4所示。

表4　高脂對(duì)檢測(cè)的影響Table 4 The influence of hyperlipemia

由表4可知，3份肺結(jié)核標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，3份非結(jié)核標(biāo)本檢測(cè)為陰性，從而表明高脂不會(huì)對(duì)試劑結(jié)果造成影響。

2．4．4類風(fēng)濕因子

為考察標(biāo)本中的RF是否會(huì)對(duì)本試劑的檢測(cè)結(jié)果造成影響，收集3份IFN-γ陽(yáng)性RF陽(yáng)性標(biāo)本（編號(hào)為16＃～18＃），3份IFN-γ陰性RF陽(yáng)性標(biāo)本（編號(hào)為19?！?1＃）用本試劑進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如表5所示。

表5　類風(fēng)濕因子對(duì)檢測(cè)的影響Table 5　The influence of RF

由表5可知，3份肺結(jié)核標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，3份非結(jié)核標(biāo)本檢測(cè)為陰性，從而表明類風(fēng)濕因子不會(huì)對(duì)試劑結(jié)果造成影響。

2．5與同類產(chǎn)品的比較

用本試劑與北京萬(wàn)泰生物藥業(yè)股份有限公司的結(jié)核分枝桿菌相關(guān)γ-干擾素檢測(cè)試劑盒（體外釋放ELISA）進(jìn)行特異性、靈敏度的比較。

用本試劑和ELISA試劑分別檢測(cè)241份臨床標(biāo)本。由表6結(jié)果可知，以北京萬(wàn)泰生物藥業(yè)股份有限公司的結(jié)核分枝桿菌相關(guān)γ-干擾素檢測(cè)試劑盒（體外釋放ELISA）的檢測(cè)結(jié)果為對(duì)照，本試劑的特異性為98．3%、靈敏度為99．2%?？偡下蔬_(dá)到98．8%。

表6　與ELISA試劑盒的符合率Table 6 Coincidence rate with the ELISA kit

用本試劑與ELISA試劑分別檢測(cè)82份臨床血漿，由圖2可知，兩者的定量值經(jīng)過(guò)直線回歸后，得到的線性回歸方程為y＝0．9930x＋0．01128，相關(guān)系數(shù)r達(dá)到0．9833，表明兩試劑有良好的相關(guān)性。

本試劑與ELISA試劑的主要性能指標(biāo)對(duì)比如表7所示。

圖2　CLIA試劑與ELISA試劑的定量相關(guān)性分析Figure 2　The quantitative correlation analysis between CLIA kit and ELISA kit

表7　CLIA試劑與ELISA試劑的比較Table 7 Comparison of the CLIA kit and the ELISA kit

3　討論

結(jié)核病作為可通過(guò)空氣傳播的疾病，其傳播能力很強(qiáng)，不易控制。在臨床上，TB-IGRA方法在結(jié)核診斷與防治上的應(yīng)用已經(jīng)越來(lái)越被認(rèn)可并采用［9-11］。

本研究所建立的人結(jié)核感染T細(xì)胞檢測(cè)方法基于全自動(dòng)管式化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行γ-干擾素釋放量的定量檢測(cè)。全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)系統(tǒng)是一個(gè)高度集成和自動(dòng)化的免疫分析系統(tǒng)，包括了免疫反應(yīng)及光檢測(cè)系統(tǒng)，樣本、試劑和耗材裝載系統(tǒng)，液體管路和電器控制系統(tǒng)，用戶操作界面等系統(tǒng)，能夠?qū)崿F(xiàn)檢測(cè)多種項(xiàng)目的一體化操作，大大提高了臨床檢測(cè)的通量與效率。另外，由于其通過(guò)反應(yīng)釋放的光子數(shù)來(lái)只是分析物的濃度，與傳統(tǒng)的ELISA相比，其具有更高的靈敏度，更寬的線性范圍及更好的重復(fù)性。

在臨床應(yīng)用中，現(xiàn)有采用ELISA方法測(cè)定γ-干擾素釋放量的商品化試劑盒（北京萬(wàn)泰生物藥業(yè)股份有限公司）對(duì)結(jié)果陰陽(yáng)性的判定中最為重要的一個(gè)條件是測(cè)試培養(yǎng)管T的γ－干擾素釋放量相對(duì)于本底對(duì)照培養(yǎng)管N的γ-干擾素釋放量升高14 pg／mL，而N管的檢測(cè)值一般是趨近于檢測(cè)下限的。該ELISA試劑的劑量反應(yīng)曲線范圍為12．5 pg／mL～400 pg／mL，濃度為14 pg／mL樣本的檢測(cè)已經(jīng)接近其線性范圍下限，所以在臨床使用中對(duì)于操作人員就有較高的要求，對(duì)于T管實(shí)際γ-干擾素含量在14 pg／mL附近的樣本的檢測(cè)需要足夠的準(zhǔn)確，輕微的誤差就可能引起對(duì)樣本陰陽(yáng)性的判定的不同。而本研究所建立的基于全自動(dòng)管式化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)系統(tǒng)的γ-干擾素釋放量的定量檢測(cè)，其檢測(cè)的線性范圍為1 pg／mL～5 000 pg／mL，能夠?qū)^大多數(shù)的臨床樣本的T管作出準(zhǔn)確的定量檢測(cè)。

本方法與現(xiàn)有采用ELISA方法測(cè)定γ-干擾素釋放量的商品化試劑盒（北京萬(wàn)泰生物藥業(yè)股份有限公司）的主要性能對(duì)比如表7所示，其靈敏度、線性范圍均有大幅提高，且具有良好的抗干擾能力。該方法的建立可為臨床檢測(cè)結(jié)核感染提供更加強(qiáng)有力的工具。

參考文獻(xiàn)

[1]World Health Organization. Tuberculosis [J]. Saudi Medical Journal, 2013,34(11):1205-1207.

[2]Farris AB, Branda JA. QuantiFERON-TB gold assay for tuberculosis infection [J].Clinical Microbiology Newsletter, 2007,29(17):129-136.

[3]Winthrop KL. The risk and prevention of tuberculosis: screening strategies to detect latent tuberculosis among rheumatoid arthritis patients who use biologic therapy [J]. International Journal of Advances in Rheumatology, 2010,8(2):43-52.

[4]Winthrop KL, Nyendak M, Calvet H, et al. Interferonγ release assays for diagnosing Mycobacterium tuberculosis infection in renal dialysis patients [J]. Clinical Journal of the American Society of Nephrology, 2008, 3(5):1357-1363.

[5]Richeldi L, Losi M, D'Amico R, et al. Performance of tests for latent tuberculosis in different groups of immunocompromised patients[J]. Chest Journal, 2009, 136 (1):198-204.

[6]Piana F, Codecasa LR, Cavallerio P, et al. Use of a T-cell-based test for detection of tuberculosis infection among immunocompromised patients[J]. European Respiratory Journal, 2006,28(1):31-34.

[7]Gámiz-Gracia L, García-Campa觡a AM, Soto-Chinchilla JJ, et al. Analysis of pesticides by chemiluminescence detection in the liquid phase[J]. Trzc Trends in Analytical Chemistry, 2005,24(11):927-942.

[8]Tao X, Wang W, Wang Z, et al. Development of a highly sensitive chemiluminescence enzyme immunoassay using enhanced luminol as substrate[J]. Luminescence, 2014,29(4):301-306.

[9]蔣英,趙蓉,張勝男,等.干擾素釋放酶聯(lián)免疫法(TB-IGRA)用于檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的優(yōu)越性[J].實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué), 2012,19(1):24-26.

[10]Kleinert S, Tony HP, Krueger K, et al. Screening for latent tuberculosis infection: performance of tuberculin skin test and interferon-γ release assays under real-life conditions[J]. Annals of the Rheumatic Diseases, 2012, 71(11):1791-1795.

[11]Mariette X, Baron G, Tubach F, et al. Influence of replacing tuberculin skin test with ex vivo interferon γ release assays on decision to administer prophylactic antituberculosis antibiotics before anti-TNF therapy[J]. Annals of the Rheumatic Diseases, 2012,71(11):1783-1790.

通訊作者：★張軍，E-mail：zhangj＠xmu．edu．cn

基金項(xiàng)目：國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）（2011AA02A101）