王新靈　李忠信　關(guān)　學(xué)　渠　海

基于磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法的肝纖四項(xiàng)檢測(cè)限與功能靈敏度研究

王新靈1李忠信2★關(guān)學(xué)2渠海2

［摘要］目的評(píng)價(jià)磁微粒化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)肝纖維化血清學(xué)標(biāo)志物（透明質(zhì)酸、層粘連蛋白、Ⅲ型前膠原N端肽、Ⅳ型膠原）的空白限、檢出限和功能靈敏度。方法參照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）文件，利用空白樣品及系列梯度稀釋樣品在AutoLumo A2000全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光測(cè)定系統(tǒng)上進(jìn)行檢測(cè)，確定該方法配套試劑的空白限、檢出限及功能靈敏度。結(jié)果透明質(zhì)酸的空白限為7．59 ng／mL，檢出限為16．17 ng／mL，20%變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）功能靈敏度為18．72 ng／mL；層粘連蛋白的空白限為1．38 ng／mL，檢出限為3．53 ng／mL，20%CV功能靈敏度為4．16 ng／mL；Ⅲ型前膠原N端肽的空白限為0．89 ng／mL，檢出限為2．40 ng／mL，20%CV功能靈敏度為2．48 ng／mL；Ⅳ型膠原的空白限為2．42 ng／mL，檢出限為6．49 ng／mL，20%CV功能靈敏度為9．21 ng／mL。結(jié)論AutoLumo A2000全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光測(cè)定儀肝纖四項(xiàng)的空白限、檢出限和功能靈敏度的建立為臨床診斷和治療提供了更有價(jià)值的信息。

［關(guān)鍵詞］血清學(xué)；肝纖維化；磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法；空白限；檢出限；功能靈敏度

作者單位：1．河南中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，河南，鄭州450046 2．鄭州安圖生物工程股份有限公司，河南，鄭州450016

Research on magnetism particulate immuno chemistry luminescence method for limit of detection and functional sensitivity of four items of liver fibrosis

WANG Xinling1, LI Zhongxin2★, GUAN Xue2, QU Hai2
(1. School of Pharmacy, Henan University of Traditional Chinese Medicine, Zhengzhou, Henan, China, 450046; 2. Zhengzhou Autobio Biological Engineering Co.Ltd, Zhengzhou, Henan,China, 450016)

[ABSTRACT] Objective To evaluate the limit of blank(LoB), limit of detection(LoD) and functional sensitivity(F.S) of serum items for liver fibrosis[hyaluronic acid(HA), laminin(LN), procollagen type III N-terminal Propeptide(PIIINP), collagen type IV(CIV)] by magnetism particulate immuno chemistry luminescence method.MethodsThe LoB, LoD and F.S were confirmed by using the blank samples and series gradient dilution samples on AutoLumo A2000 in accordance with the files of clinical and laboratory standards institute (CLSI).Results The LoB of HA, LN, PIIINP, and CIV were 7.59 ng/mL, 1.38 ng/mL, 0.89 ng/mL and 2.42 ng/mL, respectively. The LoD of HA, LN, PIIINP, and CIV were 16.17 ng/mL, 3.53 ng/mL, 2.40 ng/mL and 6.49 ng/mL, respectively. The 20% CV F.S of HA, LN, PIIINP, and CIV were 18.72 ng/mL, 4.16 ng/mL, 2.48 ng/mL and 9.21 ng/mL, respectively. Conclusion More valuable informations for clinical diagnosis and treatment were provided by cofirming the LoB, LoD and F.S of the four liver fibrosis serum items on AutoLumo A2000.

[KEY WORDS]Serology; Liver fibrosis; Magnetism particulate immuno chemistry luminescence method; Limit of blank (LoB); Limit of detection (LoD); Functional sensitivity (F.S)

肝纖維化是緊隨肝細(xì)胞破壞之后的自身修復(fù)過程，是慢性肝病發(fā)展為肝硬化的必經(jīng)之路，其實(shí)質(zhì)是細(xì)胞外基質(zhì)合成與降解失衡，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)尤其是膠原在肝內(nèi)的過度增加和沉積［1-2］。肝纖維化血清學(xué)四項(xiàng)指標(biāo)是目前最為常用的檢測(cè)肝纖維化的血清學(xué)指標(biāo)，包括透明質(zhì)酸（hyaluronic acid，HA）、層粘連蛋白（laminin，LN）、Ⅲ型前膠原N端肽（procollagen typeⅢN-terminal propeptide，PIIINP）和Ⅳ型膠原（collagen type IV，CIV）。隨著免疫學(xué)檢測(cè)的發(fā)展，化學(xué)發(fā)光法特別是全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于血清學(xué)標(biāo)志物的檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)室利用國(guó)產(chǎn)全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀，根據(jù)《醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則CNAS-CL 02：2012／ISO 15189：2012》、《醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則在臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域的應(yīng)用說明CNAS-CL39》，采用美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）的相關(guān)文件介紹的方法，對(duì)肝纖四項(xiàng)磁微粒化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)試劑的空白限（limit of blank，LoB）、檢出限（limit of detection，LoD）、功能靈敏度（functional sensitivity，F(xiàn)．S）等性能指標(biāo)進(jìn)行研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　材料和方法

1．1材料

1．1．1儀器與試劑

鄭州安圖生物工程股份有限公司生產(chǎn)的全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光測(cè)定儀AutoLumo A2000及其配套肝纖維化檢測(cè)試劑（試劑批號(hào)：HA：20140124；LN：20140108；PIIINP：20140321；CIV：20140312）；安圖公司通用稀釋液（批號(hào)：2014040101）及2水平質(zhì)控品（批號(hào)：HA：20131201；LN：20140114；PIIINP：20131119；CIV：20130910）。按說明書要求保存。

1．1．2臨床樣本收集

收集鄭州市第六人民醫(yī)院健康男性體檢低值新鮮血清20例（要求無任何可見疾病癥狀的健康人，酒精肝、脂肪肝、藥物肝、各種肝損害應(yīng)當(dāng)排除），年齡18歲～22歲，平均19．7歲，于37℃下溫育30 min后，置于離心機(jī)以4 000 rpm離心10 min，分離血清，混合備用。

1．2方法

1．2．1檢測(cè)儀器的維護(hù)與質(zhì)量控制

每天實(shí)驗(yàn)前后均對(duì)儀器進(jìn)行維護(hù)保養(yǎng)，嚴(yán)格按照說明書要求進(jìn)行操作，并執(zhí)行定期校準(zhǔn)。利用各項(xiàng)目質(zhì)控品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前的室內(nèi)質(zhì)控，失控發(fā)生時(shí)測(cè)定的樣本數(shù)據(jù)不采用。

1．2．2確定LoB的程序

按照CLSI EP17-A文件進(jìn)行［3］。利用通用稀釋液做空白樣品，每個(gè)項(xiàng)目每天檢測(cè)2批，間隔不小于2 h，每批6個(gè)重復(fù)，共進(jìn)行5 d，記錄檢測(cè)濃度值，每個(gè)項(xiàng)目分別獲得60個(gè)結(jié)果。按ISO推薦在規(guī)定水平的Ⅰ類錯(cuò)誤下，設(shè)定α＝5%，即LoB有5%的可能性含有待測(cè)物。采用非參數(shù)檢驗(yàn)，將空白樣品的結(jié)果由小到大排序，第95百分位數(shù)值即為L(zhǎng)oB。

1．2．3梯度樣品制備

混合均勻后的健康人體檢血清分別進(jìn)行4個(gè)指標(biāo)的測(cè)定，每個(gè)指標(biāo)3個(gè)重復(fù)，記錄檢測(cè)結(jié)果，并計(jì)算各指標(biāo)平均濃度值；根據(jù)LoB結(jié)果，利用通用稀釋液對(duì)混合血清按照測(cè)定的平均值進(jìn)行系列稀釋，樣品的濃度范圍在LoB的1倍～4倍之間，每個(gè)指標(biāo)各稀釋5個(gè)梯度，用來確定LoD、F．S。

1．2．4確定LoD的程序

按照CLSI EP17-A文件進(jìn)行［3］。對(duì)每個(gè)項(xiàng)目的系列稀釋樣本進(jìn)行相應(yīng)指標(biāo)檢測(cè)，每天各檢測(cè)2批，間隔不小于2 h，每個(gè)指標(biāo)2個(gè)重復(fù)，共進(jìn)行5 d，記錄檢測(cè)濃度值，每個(gè)項(xiàng)目分別獲得100個(gè)結(jié)果，將結(jié)果從小到大排列。為了強(qiáng)調(diào)Ⅱ類錯(cuò)誤，設(shè)定β＝5%，即LoD有5%的可能性不含有待測(cè)物。采用非參數(shù)估計(jì)LoD，LoD＝LoB＋DS，β。DS，β是低濃度樣品測(cè)定值中位數(shù)的值和低濃度樣品的第5個(gè)百分位數(shù)值的間距。

1．2．5確定F．S的程序

功能靈敏度用于確定檢測(cè)系統(tǒng)可報(bào)告的最低限值，以天間重復(fù)檢測(cè)的變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）為20%時(shí)對(duì)應(yīng)LoD樣品具有的平均濃度為該試劑的F．S。

2　結(jié)果

2．1 LoB結(jié)果

采用非參數(shù)檢驗(yàn)，將空白樣品的結(jié)果由小到大排序，第95百分位數(shù)值即為L(zhǎng)oB。

公式：P（1－α）＝（1-α）%×NB＋0．5

其中：α為Ⅰ型錯(cuò)誤，設(shè)定5%；P（1-α）為在（1-α）百分位數(shù)位置的值；NB為空白樣本的重復(fù)檢測(cè)次數(shù)。

根據(jù)以上公式，得出第95百分位數(shù)值為所有空白樣本檢測(cè)結(jié)果按從低到高順序排列的第57．5位數(shù)值。表1為各項(xiàng)目空白樣品檢測(cè)結(jié)果排序后第51位～第60位的數(shù)值。計(jì)算各項(xiàng)目第57．5位的結(jié)果即為此項(xiàng)目的LoB，見表2。

表2　肝纖四項(xiàng)LoB結(jié)果（ng／mL）Table 2　The results of LoB of four items of liver fibrosis （ng／mL）

2．2混合血清原始結(jié)果

混合均勻后健康人體檢血清肝纖四項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果見表3。

表3　混合血清肝纖四項(xiàng)原始結(jié)果（ng／mL）Table 3　The results of four items of liver fibrosis in pooled serum（ng／mL）

2．3系列稀釋樣品梯度選擇

利用混合血清制備4個(gè)項(xiàng)目系列稀釋樣品的制備濃度見表4。

表4　肝纖四項(xiàng)系列稀釋樣品制備濃度（ng／mL）Table 4　The results of four items of liver fibrosis in series gradient dilution samples（ng／mL）

2．4 LoD結(jié)果

4個(gè)項(xiàng)目5個(gè)梯度樣品測(cè)定的結(jié)果按由小到大排序，將第1位～第10位和第46位～第55位結(jié)果記錄于表5中。根據(jù)公式LoD＝LoB＋DS，β。其中DS，β是中位數(shù)值和第5個(gè)百分位數(shù)值的間距。中位數(shù)值為第50．5位置結(jié)果，第5百分位數(shù)值為第5位置結(jié)果。DS，β＝第50．5位置結(jié)果－第5位置結(jié)果。故可計(jì)算出各項(xiàng)目LoD，見表6。

2．5 F．S結(jié)果

分別計(jì)算4個(gè)項(xiàng)目5個(gè)梯度樣品測(cè)定結(jié)果的平均值、標(biāo)準(zhǔn)差和CV，結(jié)果如表7所示。按照天間重復(fù)檢測(cè)的CV≤20%的要求，各項(xiàng)目天間CV最接近20%所對(duì)應(yīng)的濃度值即為此項(xiàng)目的F．S。由表7可看出，HA濃度為18．72 ng／mL、LN濃度為4．16 ng／mL、PⅢNP濃度為2．48ng／mL、CⅣ濃度為9．21ng／mL時(shí)，天間CV最接近20%，故此濃度即為各項(xiàng)目的F．S。

3　討論

肝纖維化不是一個(gè)獨(dú)立的疾病，而是許多慢性肝病發(fā)展為肝硬化的共同病理過程，對(duì)肝纖維化的早發(fā)現(xiàn)、早治療有著重要意義［4］。血清學(xué)檢測(cè)由于其無創(chuàng)傷性，同時(shí)具有簡(jiǎn)單、方便、利于動(dòng)態(tài)檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)，從而成為肝纖維化診斷的重要輔助手段［5］。近年來人們對(duì)肝纖維化研究的興趣與日俱增，在診斷和治療方面也取得一定的進(jìn)展。姚真榮等利用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)132例乙型病毒性肝炎患者血清中肝纖維化四項(xiàng)指標(biāo)的水平，發(fā)現(xiàn)單個(gè)指標(biāo)檢測(cè)中，HA是四項(xiàng)指標(biāo)中鑒別診斷肝炎與肝硬化最有價(jià)值的一項(xiàng)；通過HA聯(lián)合其他指標(biāo)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其中HA和PIIINP組合特異性、準(zhǔn)確性最高［6］。目前國(guó)外學(xué)者對(duì)肝纖維化的檢測(cè)與治療方面研究較少，并且利用肝纖四項(xiàng)作為肝纖維化檢測(cè)血清學(xué)標(biāo)志物的研究更加稀少，僅是將其中的某一項(xiàng)或某幾項(xiàng)作為檢測(cè)標(biāo)志物。Catanzaro等利用透明質(zhì)酸、Ⅲ型前膠原肽、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑Ⅰ型作為標(biāo)志物與肝活檢進(jìn)行比對(duì)研究，建立起一種用于肝纖維化進(jìn)程檢測(cè)的非侵入性方法［7］；Zeuzem等研究了faldaprevir、deleobuvir、和ribavirin等藥物在治療慢性丙肝引起的晚期肝纖維化或肝硬化方面的療效和安全性［8］。分析國(guó)外研究較少的原因，筆者認(rèn)為可能與肝臟疾病在流行病學(xué)上主要集中在國(guó)內(nèi)、肝纖四項(xiàng)在檢測(cè)肝纖維化上缺乏組織特異性及醫(yī)學(xué)倫理等方面相關(guān)。

表5　各項(xiàng)目梯度樣品第1－10位和第46－55位結(jié)果（ng／mL）Table 5　The results of 1－10 and 46－55 in series gradient dilution samples（ng／mL）

表6　肝纖四項(xiàng)LoD結(jié)果（ng／mL）Table 6　The results of LoD of four items of liver fibrosis （ng／mL）

表7　肝纖四項(xiàng)梯度稀釋樣品檢測(cè)CV統(tǒng)計(jì)結(jié)果Table 7　The results of CV of four items of liver fibrosis in series gradient dilution samples

醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室在使用某種檢測(cè)系統(tǒng)或檢驗(yàn)方法前均應(yīng)對(duì)該系統(tǒng)或方法的分析性能進(jìn)行評(píng)價(jià)，選擇性能優(yōu)良的檢測(cè)系統(tǒng)或檢驗(yàn)方法是保證病人檢驗(yàn)結(jié)果真實(shí)、可靠的前提。隨著全自動(dòng)檢測(cè)儀器的廣泛使用，檢驗(yàn)工作者更加重視完成一個(gè)檢驗(yàn)項(xiàng)目所涉及的儀器、試劑等組成的檢測(cè)系統(tǒng)的可靠性。戴悅等按美國(guó)病理家協(xié)會(huì)和ISO15189實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可的要求，對(duì)羅氏電化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)促甲狀腺激素受體抗體檢測(cè)方法進(jìn)行評(píng)價(jià)和性能驗(yàn)證，雖然各項(xiàng)指標(biāo)均能滿足臨床要求，但提示評(píng)價(jià)結(jié)果與廠商提供的并不完全相同，建議各實(shí)驗(yàn)室應(yīng)自主設(shè)立相應(yīng)的分析性能指標(biāo)［9］。在實(shí)際檢驗(yàn)工作中，參考CLSI發(fā)布的方法學(xué)評(píng)價(jià)系列文件（EP05-A2、EP06-A、EP09-A2、EP15-A2、EP17-A等）對(duì)檢測(cè)方法和檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行性能評(píng)價(jià)已經(jīng)成為趨勢(shì)。目前檢驗(yàn)工作者需要首先擺脫對(duì)相關(guān)性能指標(biāo)定義不明確的現(xiàn)象。結(jié)合本文，LoB、LoD與F．S均是評(píng)價(jià)檢測(cè)系統(tǒng)或方法的靈敏度性能，但與分析靈敏度容易混淆。張秀明等針對(duì)臨床實(shí)驗(yàn)室、儀器和試劑生產(chǎn)廠商及檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)期刊中不能正確理解和區(qū)別靈敏度和檢出限的現(xiàn)象，對(duì)它們進(jìn)行詳細(xì)的分析比較，并給出正確使用的方法［10］。

國(guó)內(nèi)外鮮有利用EP文件研究肝纖維化血清標(biāo)志物檢測(cè)試劑分析性能的相關(guān)報(bào)道，特別是對(duì)空白限、檢出限和功能靈敏度的研究更加匱乏。目前國(guó)內(nèi)研究較多的集中在肝纖維化血清學(xué)檢測(cè)的方法建立上。張運(yùn)洪等對(duì)肝纖四項(xiàng)化學(xué)發(fā)光試劑的精密度、加樣針攜帶污染率、準(zhǔn)確度、線性范圍和參考區(qū)間進(jìn)行驗(yàn)證，顯示四項(xiàng)的批內(nèi)變異均在5%以內(nèi)，批間變異均在6%以內(nèi)，準(zhǔn)確性的偏差均不超過2%，攜帶污染、線性范圍和參考區(qū)間均符合預(yù)期要求［11］。此研究雖利用EP文件進(jìn)行性能指標(biāo)評(píng)價(jià)，但并不涉及靈敏度各指標(biāo)，同時(shí)其使用的是評(píng)價(jià)方法，而非建立方法。在實(shí)際應(yīng)用中，建立方法雖然復(fù)雜，可客觀性和有效性要優(yōu)于評(píng)價(jià)方法。

隨著EP文件的普及，利用此文件進(jìn)行檢測(cè)系統(tǒng)及方法的性能建立及評(píng)價(jià)已經(jīng)成為生產(chǎn)商和檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的首選，也必將成為性能評(píng)價(jià)方法的“金標(biāo)準(zhǔn)”。本文參考CLSI發(fā)布的EP文件，利用國(guó)產(chǎn)全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)，采用性能確認(rèn)方法，對(duì)肝纖四項(xiàng)血清學(xué)標(biāo)志物檢測(cè)試劑的空白限、檢出限和功能靈敏度進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示各檢測(cè)限值均低于廠家聲明值，可在低值區(qū)樣本的準(zhǔn)確定量和穩(wěn)定檢測(cè)方面發(fā)揮更加重要的作用。

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通訊作者：★李忠信，E-mail：lizhongxin＠autobio．com．cn

基金項(xiàng)目：國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）（2011AA02A101）