張　磊，魯淑婷，李玉龍，黃洲風(fēng)*

(1.河南省人民醫(yī)院 血液病研究所，河南 鄭州450003；2.鄭州市第一人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科，河南 鄭州450004)

甲型肝炎病毒和戊型肝炎病毒雙重?zé)晒舛縋CR方法的建立及應(yīng)用

張磊1，魯淑婷2，李玉龍1，黃洲風(fēng)1*

(1.河南省人民醫(yī)院 血液病研究所，河南 鄭州450003；2.鄭州市第一人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科，河南 鄭州450004)

摘要：目的建立甲型肝炎病毒(HAV)和戊型肝炎病毒(HEV)的雙重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)方法并應(yīng)用于臨床樣本的檢測(cè)。方法根據(jù)參考文獻(xiàn)分別選取HAV以及HEV基因組的保守區(qū)域設(shè)計(jì)合成特異性引物和探針，從而建立并優(yōu)化雙重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)體系，之后評(píng)價(jià)反應(yīng)體系的特異性、敏感性和穩(wěn)定性。結(jié)果本研究建立的HAV和HEV雙重?zé)晒舛縋CR技術(shù)應(yīng)用于檢測(cè)HAV核酸時(shí)檢測(cè)極限可以達(dá)到1個(gè)拷貝/反應(yīng)，對(duì)同一樣品重復(fù)測(cè)定5次獲得的Ct值的變異系數(shù)(CV)最大為1.5%，同時(shí)該體系檢測(cè)HEV的最低檢測(cè)極限也達(dá)到10個(gè)拷貝/反應(yīng)，重復(fù)測(cè)試5次后Ct值的變異系數(shù)(CV)最大為2.6%，臨床樣本測(cè)試結(jié)果顯示該體系能夠?qū)仔透窝缀臀煨透窝着R床樣本中的病毒進(jìn)行定量。結(jié)論本研究成功建立了HAV和HEV雙重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)方法，靈敏度高，穩(wěn)定性好，可以同時(shí)準(zhǔn)確定量HAV和HEV，為這兩種病毒的分子病原學(xué)診斷提供了一種更加快速的手段。

關(guān)鍵詞：甲型肝炎病毒；戊型肝炎病毒；雙重?zé)晒舛縋CR；敏感性

(ChinJLabDiagn,2015,19:2063)

甲型肝炎病毒(Hepatitis A Virus，HAV)和戊型肝炎病毒(Hepatitis E Virus，HEV)均是能夠引起急性肝炎暴發(fā)的致病因子，歷史上都曾多次造成疾病流行，帶來過很嚴(yán)峻的公共衛(wèi)生問題[1]。雖然在分類學(xué)上這兩個(gè)病毒相去甚遠(yuǎn)，但從流行病學(xué)的角度來看，HAV和HEV的分布均具有明顯的區(qū)域性特征，在發(fā)展中國(guó)家流行較廣，尤其是衛(wèi)生條件較差的區(qū)域，這在很大程度上應(yīng)該歸因于兩種病毒具有相似的傳播途徑，都是通過糞口途徑傳播，事實(shí)證明：直接接觸感染者的排泄物或排泄物污染過的水、土壤甚至接觸感染者存在的環(huán)境都有可能造成HAV和HEV感染，因此對(duì)于排泄物中以及環(huán)境中和蔬菜食品中的病毒檢測(cè)便顯得尤其重要，然而，這兩種病毒都很難進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，或可以培養(yǎng)但不出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病理效應(yīng)，因此對(duì)HAV和HEV的檢測(cè)便主要依賴于核酸的檢測(cè)，目前實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)以其靈敏度高，檢測(cè)速度快，特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，已在很多種病原體的核酸定量檢測(cè)中得到了廣泛的應(yīng)用，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)又主要分為SYBR Green染料技術(shù)和TaqMan探針技術(shù)兩種，兩種方法相比，TaqMan探針技術(shù)具有更好的特異性，且花費(fèi)更低、易于設(shè)計(jì)，所以本研究探索建立了基于TaqMan技術(shù)的HAV和HEV雙重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)方法。

1材料與方法

1.1血清樣品和對(duì)照病毒株來源用于制備HAV和HEV定量標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)粒模板由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所饋贈(zèng)。檢驗(yàn)反應(yīng)體系特異性時(shí)用到的麻疹病毒核酸(RNA)、脊髓灰質(zhì)炎病毒核酸(RNA)、風(fēng)疹病毒核酸(RNA)、呼吸道合胞病毒核酸(RNA)、流感病毒核酸(RNA)、輪狀病毒核酸(RNA)、諾如病毒核酸(RNA)、星狀病毒核酸(RNA)以及腸道腺病毒核酸(DNA)來自于中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所，所有RNA儲(chǔ)存于-70℃超低溫冰箱。10份甲型肝炎患者和10份戊型肝炎患者的血清樣本由河南省人民醫(yī)院感染科收集饋贈(zèng)，保存于-20℃。

1.2引物和探針的設(shè)計(jì)合成根據(jù)參考文獻(xiàn)[2-5]確定HAV的擴(kuò)增靶點(diǎn)位于病毒基因組的5′-NCR，選取合適的引物和探針，探針5′端標(biāo)記FAM熒光報(bào)告基團(tuán)，而HEV的擴(kuò)增區(qū)域位于HEV ORF2區(qū)，為實(shí)現(xiàn)單管雙重的擴(kuò)增效果，HEV探針5′端標(biāo)記Cy5熒光報(bào)告基團(tuán)，本研究中用到的所有引物和探針均委托寶生物工程(大連)有限公司合成，序列名稱和標(biāo)記如表1所示。

表1　HAV和HEV雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR的引物和探針

1.3標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建和制備以帶有HAV和HEV擴(kuò)增靶序列的質(zhì)粒作為轉(zhuǎn)錄模板，使用RiboMAXTM Large Scale RNA Production Systems-T7(Promega)試劑盒，在T7 RNA聚合酶的作用下，分別轉(zhuǎn)錄生成HAV定量和HEV定量用的RNA標(biāo)準(zhǔn)品，之后加入Dnase RQI 37℃作用15 min降解DNA模板，RNA產(chǎn)物經(jīng)純化后溶于DEPC水，使用紫外分光光度計(jì)(Nanodrop)測(cè)定其濃度并根據(jù)相對(duì)分子量計(jì)算其拷貝數(shù)濃度，最終倍比稀釋成1×107-1×100拷貝/μl作為HAV和HEV熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)品。

1.4臨床血清樣本中病毒RNA的提取從臨床血清樣本中提取病毒RNA采用QIAamp Viral RNA mini kit(Qiagen)，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，提取出的HAV和HEV RNA洗脫于60 μl DEPC處理的水中。

1.5HAV HEV雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR本研究使用One Step PrimeScriptTMRT-PCR Kit (TaKaRa) 在ABI Real-time PCR 7500儀器上進(jìn)行熒光定量檢測(cè)，反應(yīng)體系配制如下：2× one step RT-PCR Buffer III 12.5 μl,TaKaRa ExTaqTMHS 0.5μl,PrimeScriptTMRT Enzyme Mix II 0.5 μl,ROX Reference Dye II 0.5 μl，反應(yīng)后得到樣本的閾值循環(huán)數(shù)(Ct)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中含有的RNA拷貝數(shù)。

1.6確定雙重?zé)晒舛縋CR的最優(yōu)反應(yīng)條件以制備的HAV和HEV RNA標(biāo)準(zhǔn)品作為模板，分別選用0.2 μM、0.4 μM和0.6 μM濃度的熒光探針以及0.2 μmol/L、0.4 μmol/L和0.6 μmol/L的上下游引物濃度進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，通過比較不同濃度的上下游引物及探針組合優(yōu)化本實(shí)驗(yàn)體系，最終通過矩陣法優(yōu)選出最佳工作濃度，另外，對(duì)雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR的反應(yīng)條件進(jìn)行摸索，確定最優(yōu)變性溫度和退火溫度。

2結(jié)果

2.1最適反應(yīng)條件的確定以25 μl為反應(yīng)總體積，通過對(duì)不同濃度的引物、Taq-Man探針以及退火溫度的篩選、比較和優(yōu)化，確定最佳反應(yīng)體系為：HAV和HEV熒光標(biāo)記探針濃度為0.2μM、上下游引物分別為0.4 μmol/L，最適的退火溫度確定為60℃，因此雙重?zé)晒舛縋CR最終的反應(yīng)條件設(shè)置如下：42℃30 min，95℃10 sec，95℃5 sec，60℃34 sec，共40個(gè)循環(huán)。

2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立以體外轉(zhuǎn)錄并純化后獲得的HAV和HEV RNA分子拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)(X)，以Ct值為縱坐標(biāo)(Y)，建立HAV和HEV實(shí)時(shí)熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)在100-107之間時(shí)，HAV熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線呈良好的線性，斜率為-3.287，相關(guān)系數(shù)R2=0.999，最低檢測(cè)極限為1個(gè)拷貝/反應(yīng)，而HEV熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率為-3.829，最低檢測(cè)極限為10個(gè)拷貝/反應(yīng)。

2.3HAV HEV雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR的靈敏度和特異性檢測(cè)以系列稀釋的HAV和HEV RNA標(biāo)準(zhǔn)品作為反應(yīng)模板，分別評(píng)估該實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系檢測(cè)HAV核酸和HEV核酸的靈敏程度，確定HAV和HEV的最低檢測(cè)極限分別為1個(gè)拷貝/反應(yīng)和10個(gè)拷貝/反應(yīng)。當(dāng)使用該反應(yīng)體系檢測(cè)麻疹病毒核酸(RNA)、脊髓灰質(zhì)炎病毒核酸(RNA)、風(fēng)疹病毒核酸(RNA)、呼吸道合胞病毒核酸(RNA)、流感病毒核酸(RNA)、輪狀病毒核酸(RNA)、諾如病毒核酸(RNA)、星狀病毒核酸(RNA)以及腸道腺病毒核酸(DNA)時(shí)， 均未檢測(cè)出陽性擴(kuò)增信號(hào)，表明該系統(tǒng)具有良好的特異性。

2.4HAV HEV雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR的重復(fù)性檢測(cè)為了評(píng)價(jià)熒光定量PCR體系檢測(cè)HAV核酸和HEV核酸的穩(wěn)定性，分別使用6個(gè)濃度(101-106拷貝/反應(yīng))的HAV RNA標(biāo)準(zhǔn)品和HEV RNA標(biāo)準(zhǔn)品作為模板進(jìn)行平行的5次重復(fù)測(cè)試。結(jié)果如表2所示，檢測(cè)不同稀釋度的HAV時(shí)Ct值的變異系數(shù)(CV)最大為1.5%，而測(cè)試HEV的變異系數(shù)(CV)最大為2.6%，說明所建立的雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)體系具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性。

表2　HAV HEV雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR的可重復(fù)性

2.5HAV HEV雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)體系的應(yīng)用通過本研究中建立的HAV HEV雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)體系檢測(cè)了10份處于急性期的甲型肝炎患者的血清樣本和10份戊型肝炎患者的血清樣本，結(jié)果均為陽性，檢出率100%，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到臨床樣本中HAV RNA拷貝數(shù)范圍從1.57×103拷貝/ml到6.92×107拷貝/ml而戊型肝炎患者的臨床樣本中HEV RNA拷貝數(shù)范圍從5.44×105拷貝/ml到2.19×107拷貝/ml。

3討論

一套成功的實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的建立主要取決于探針和引物的選擇，需要對(duì)兩種病毒的基因結(jié)構(gòu)有比較深入的了解，HAV的基因組為一條單股正鏈的RNA分子，全長(zhǎng)在7470-7478bp之間，僅含有一個(gè)開放讀碼框架[6]，由于不同的HAV分離株核酸序列高度同源，設(shè)計(jì)HAV實(shí)時(shí)熒光定量PCR的引物和探針相對(duì)容易，但HEV卻型別眾多，文獻(xiàn)報(bào)道至少有4個(gè)不同的HEV基因型，各基因型之間核苷酸序列同源性僅為74%-76%[7]，給核酸檢測(cè)帶來一定的難度，而且要把與HAV和HEV的檢測(cè)體系整合，建立同一溫度和條件下的雙重?zé)晒舛縋CR也對(duì)引物和探針的設(shè)計(jì)提出了較高的要求，所以本研究參考了前人對(duì)于HAV和HEV核酸定量的研究，選擇了合適的引物和探針，并對(duì)引物探針的濃度、變性溫度、退火溫度等反應(yīng)條件進(jìn)行了反復(fù)的摸索，最終確立95℃變性、60℃退火是同時(shí)擴(kuò)增HAV和HEV的最適反應(yīng)條件。

經(jīng)過對(duì)體外制備的HAV RNA標(biāo)準(zhǔn)品、HEV RNA標(biāo)準(zhǔn)品以及其它多種病原體核酸的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)本研究中建立的HAV HEV雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)體系不僅特異性高，而且非常敏感，其中對(duì)于HAV核酸的檢測(cè)極限可以達(dá)到1個(gè)拷貝/反應(yīng)，高于國(guó)內(nèi)外類似方法的靈敏程度，而重復(fù)性實(shí)驗(yàn)表明，同一稀釋度重復(fù)5次測(cè)量Ct值的變異系數(shù)僅為1.5%和2.6%，說明此反應(yīng)具有很好的穩(wěn)定性，可以進(jìn)行可靠、穩(wěn)定的檢測(cè)。

臨床樣本的測(cè)試結(jié)果顯示，本研究建立的HAV HEV雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)體系能夠從處于急性期的甲型肝炎患者和戊型肝炎患者的血清樣本中檢測(cè)出HAV和HEV核酸，這預(yù)示著該體系可用于甲型肝炎和戊型肝炎早期的臨床診斷，除此之外，由于本方法快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，所以對(duì)急性肝炎暴發(fā)的預(yù)防和控制以及流行病學(xué)監(jiān)測(cè)調(diào)查也具有十分重要的實(shí)用價(jià)值。

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Development and Application of Multiplex Real-time PCR Assay for Hepatitis A Virus and Hepatitis E Virus DetectionZHANGLei1,LUShu-ting2,LIYu-long1,etal.(1.HematonosisResearchInstituteofHenanProvincialPeople’sHospital,Zhengzhou450003,China;2.LaboratoryDepartmentoftheFirstPeople'sHospitalofZhengzhouCity,Zhengzhou450004,China)

Abstract:ObjectiveTo establish a multiplex real-time PCR assay for hepatitis A virus and hepatitis E virus clinical samples detection.MethodsThe specific primers and probes in the conserved region of HAV and HEV genome were designed according to the references.Therefore,HAV-HEV multiplex real-time PCR was established and optimization followed by the evaluation of specificity,sensitivity and reproducibility.ResultsThe detection limit could up to 1 copy each reaction when HAV-HEV multiplex real-time PCR was applied for HAV detection.The same dilution of the RNA standard was analyzed in five times in parallel and the maximum coefficient of variation (CV) of Ct values was 1.5%.The detection limit was 10 copies each reaction in HEV sensitivity evaluation and the maximum CV of Ct values was 2.6% in reproducibility analysis.Clinical tests suggested HAV-HEV multiplex real-time PCR assay was able to quantify HAV and HEV in clinical samples.ConclusionThe HAV-HEV multiplex real-time PCR was established successfully.This detection method was sensitive,stable and it could be used for simultaneous quantification of HAV and HEV.It provided another rapid way for pathogenic diagnosis of these two viruses.

Key words:Hepatitis A virus;Hepatitis E virus;Multiplex real-time PCR;Sensitivity

(收稿日期：2015-01-13)

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

中圖分類號(hào)：R575.1

文章編號(hào)：1007-4287(2015)12-2063-04

*通訊作者