中國(guó)人胰腺導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀粘液性腫瘤B-RAF基因(V600E)突變的研究

張曉鴿1a，趙建軍2a，王慶宇1b，楊蕾2b*

(1.吉林大學(xué)第二醫(yī)院 a電診科;b研究中心,吉林 長(zhǎng)春130041；2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 a呼吸科；b內(nèi)鏡中心)

胰腺導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀粘液性腫瘤(Intraductal Papillary Mucinous Neoplasms of the Pancreas，IPMNs)是胰腺癌最重要及最常見(jiàn)的癌前病變之一,約占臨床診斷胰腺腫瘤的7%,占偶然發(fā)現(xiàn)的胰腺囊腫的50%[1，2]。IPMN分型包括伴輕度不典型增生、IPMN伴中度不典型增生、IPMN伴重度不典型增生及IPMN相關(guān)浸潤(rùn)性;不同分型決定著患者的治療方案和預(yù)后[3，4]。目前診斷僅憑病理形態(tài)學(xué)很難做到IPMN病理診斷及鑒別診斷準(zhǔn)確性。急需新的診斷方法以滿足臨床對(duì)于IPMN診斷的需要。當(dāng)前對(duì)IPMN分子分型的研究成為熱點(diǎn)，希望從在IPMN發(fā)病過(guò)程中起重要作用的分子中選擇出對(duì)IPMN診斷與治療有重要意義的分子標(biāo)志物[5]。

鼠類(lèi)肉瘤濾過(guò)性毒菌致癌性同源體B1(v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1,BRAF)蛋白是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶Raf家族的一個(gè)成員。這些蛋白激酶是保守的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的膜結(jié)合小G蛋白R(shí)as蛋白下游信號(hào)通路元件，RAS招募Raf蛋白至細(xì)胞膜并刺激使其被激活?；钴SB-RAF然后激活第二蛋白激酶MEK，從而激活蛋白激酶ERK。一旦被激活，ERK可進(jìn)入細(xì)胞核，通過(guò)磷酸化轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)相應(yīng)生物學(xué)活動(dòng)。該基因參與調(diào)節(jié)基因表達(dá)，細(xì)胞骨架重排，代謝反應(yīng)和協(xié)調(diào)細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖，分化，衰老，凋亡，血管生成[6]。BRAF在多種腫瘤存在突變，包括結(jié)直腸癌、惡性黑色素瘤、肺癌、甲狀腺癌、胰腺癌與肝癌均存在不同比例的突變[7-9]。BRAF其突變位點(diǎn)主要位于基因的第11與15外顯子，其中15外顯子第1799 位核苷酸上(T突變?yōu)?A)，導(dǎo)致其編碼的谷氨酸被纈氨酸取代(V600E)尤為重要，該突變可不依賴(lài)上游K-RAS的活性而激活下游通路，具有重要的生物學(xué)功能[9]。通過(guò)分析BRAF基因在IPMN病例的突變情況，探討相關(guān)臨床及病理特點(diǎn)與BRAF的基因突變有關(guān)聯(lián)，對(duì)評(píng)估IPMN惡性程度以及判定是否發(fā)生癌變具有重要意義。

1材料與方法

1.1標(biāo)本資料

收集吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院2012年1月至2014年12月所有的胰腺手術(shù)切除腫瘤，經(jīng)兩位高級(jí)病理醫(yī)師重新閱片篩查。共篩查出IPMN 31例入組，IPMN入組標(biāo)準(zhǔn):以下3條中符合任意1條均可入組。(1)通過(guò)檢體或者B超以及放射線等影像學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)胰腺導(dǎo)管有擴(kuò)張;(2)病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)囊性擴(kuò)張的導(dǎo)管內(nèi)被覆粘液上皮,或壺腹部有粘液溢出;(3)通過(guò)檢體或者B超以及放射線等影像學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)導(dǎo)管內(nèi)具有乳頭狀增生的腫瘤,并伴導(dǎo)管擴(kuò)張。擴(kuò)張的導(dǎo)管直徑不小于1 cm。所有病理學(xué)類(lèi)型及TNM分期均按照WHO標(biāo)準(zhǔn)。

1.2B-RAF基因(V600E)突變測(cè)序分析

獲取石蠟組織切片進(jìn)過(guò)二甲苯脫蠟后，收集腫瘤組織，應(yīng)用DNA提取試劑盒(FFPE gDNA miniPREP KIT,BIOMIGA)進(jìn)行組織DNA提取.以提取的DNA為模板應(yīng)用B-raf基因V600E突變檢測(cè)試劑盒(北京鑫諾美迪基因檢測(cè)技術(shù)有限公司)通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR儀(羅氏480)進(jìn)行檢測(cè)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用Fisher’s 卡方檢驗(yàn)分析B-RAF基因突變與病理學(xué)指標(biāo)之間關(guān)系，以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2結(jié)果

2.1B-RAF基因(V600E)突變檢測(cè)判定

通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)可見(jiàn)同時(shí)出現(xiàn)內(nèi)參擴(kuò)增曲線以及檢測(cè)擴(kuò)增曲線的為陽(yáng)性結(jié)果，而只出現(xiàn)內(nèi)參擴(kuò)增曲線沒(méi)有檢測(cè)擴(kuò)增曲線的為陰性結(jié)果，見(jiàn)圖1。

A圖顯示為B-RAF基因(V600E)未突變擴(kuò)增曲線；B圖顯示為B-RAF基因(V600E)突變擴(kuò)增曲線；

2.2IPMN病例基本信息以及基因突變情況

在31例IPMN病例中，男性16例(占51.61%)，女性15例(占48.39%)，平均年齡63.9歲；臨床病理分型為胃型15例(占48.39%)，腸型8例(占25.81%)，胰膽管型7例(占22.58%)，嗜酸細(xì)胞型1例(占3.22%);侵潤(rùn)型7例(占22.58%)，非侵潤(rùn)型24例(占77.42%)；高分化14例(占45.16%)，中度分化9例(占29.03%)低分化8例(占25.81%)；B-RAF基因突變?yōu)?例，占6.45%。具體結(jié)果見(jiàn)表1。

表1　IPMN病例基本信息以及B-RAF基因突變情況

23男74胃型否高胰頭—24男68胃型否高胰頭—25女53胃型否中胰頭—26女78腸型是低胰頭—27女56胰膽管型是中胰頭—28女48胃型否中胰頭和胰體—29女74胃型否中胰頭和胰體—30男72胃型否高胰頭—31男56腸型否高胰頭—

+：陽(yáng)性；—：陰性

2.3B-RAF基因突變與IPMN 病理特點(diǎn)的關(guān)系

應(yīng)用漸進(jìn)卡方以及精確卡方統(tǒng)計(jì)方法評(píng)估B-RAF基因突變與IPMN 病理特點(diǎn)的關(guān)系，結(jié)果顯示B-RAF基因突變與臨床分型無(wú)關(guān)(P=0.062)； B-RAF基因突變的IPMN發(fā)生侵潤(rùn)的頻率(100%)明顯高于未突變的IPMN(17.24%)(P=0.045)，B-RAF基因突變的IPMN低分化率(100%)明顯高于未突變的IPMN(31.03%)(P=0.046)，見(jiàn)表2。

表2　B-RAF基因突變與IPMN 病理特點(diǎn)的關(guān)系

*P<0.05

3討論

IPMN 是一種胰腺囊性疾病，在臨床相對(duì)少見(jiàn)，但有可能發(fā)展為癌性病變。雖然經(jīng)過(guò)多年的研究，但由于臨床、病理等方面的特殊，目前對(duì)IPMN的認(rèn)識(shí)不足，使其在診斷、治療方法均不相同。如能早期診斷及對(duì)其進(jìn)行干預(yù)治療，則預(yù)后明顯提高。到目前為止IPMN的遺傳分析，揭示了在許多相同基因的異常改變常規(guī)導(dǎo)管腺癌，包括KRAS基因[10]TP53[11]和CDKN2A/p16基因[12]的突變。

B-RAF基因編碼的蛋白屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶蛋白家族，位于RAS信號(hào)下游，在促進(jìn)細(xì)胞增殖方面發(fā)揮重要作用。其突變的熱點(diǎn)堿基在不同研究中不同。在對(duì)胰腺癌熱點(diǎn)基因突變的研究中，發(fā)現(xiàn)了在胰腺癌的樣本中存在B-RAF基因的突變，其主要突變?yōu)閂600E[8]。而在其他腫瘤熱點(diǎn)突變基因篩查中，發(fā)現(xiàn)BRAF突變主要發(fā)生在核苷酸1850，基因第616密碼子改變，導(dǎo)致氨基酸從絲氨酸到苯丙氨酸(S616F)[8，9]。在以往對(duì)于B-RAF基因在IPMN樣本突變檢測(cè)中，只是觀察到了S616F突變，而沒(méi)有檢測(cè)到V600E突變[13-15]。

本研究通過(guò)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)31例IPMN樣本的B-RAF基因V600E突變，結(jié)果檢測(cè)到2例樣本的突變，突變率為6.25%。通過(guò)評(píng)估B-RAF基因突變與IPMN 病理特點(diǎn)的關(guān)系，結(jié)果顯示B-RAF基因突變的IPMN發(fā)生侵潤(rùn)的頻率明顯高于未突變的IPMN，B-RAF基因突變的IPMN分化程度明顯低于未突變的IPMN。說(shuō)明B-RAF基因V600E突變可能是預(yù)測(cè)IPMN發(fā)生侵襲以及惡性程度的分子標(biāo)志物。由于本研究病例數(shù)有限，只是初步探討該基因突變?cè)贗PMN發(fā)生的頻率以及與病理學(xué)聯(lián)系，在此研究基礎(chǔ)上應(yīng)加大研究樣本數(shù)目，更加明確B-RAF基因V600E突變作為判定IPMN良惡性的分子標(biāo)志。

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(收稿日期：2015-02-19)

文章編號(hào)：1007-4287(2015)12-2077-04

*通訊作者

基金項(xiàng)目：吉林省科技廳項(xiàng)目(201215074)