王呈輝，馬婉琴，樓鈺函，倪炎棟，蔡 蘇 ，錢永生，吳劍丙

(杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江杭州 3 10036)

杭白菊 (white Chrysanthemum morifolium)系菊科多年生草本植物，也稱杭菊、茶菊，是著名的“浙八味”之一［1］。作為傳統(tǒng)的栽培藥用植物，杭白菊被廣泛應(yīng)用于中藥調(diào)理、養(yǎng)生飲品等方面，深受廣大消費(fèi)者的青睞［2-3］。近年來(lái)因連作、重肥、氣候、環(huán)境等因素，使杭白菊病害問(wèn)題日益突出。其中的典型病害就包括葉枯病、根腐病、病毒病等［4］。在實(shí)際生產(chǎn)中，由于農(nóng)民常常缺乏必要的病害識(shí)別與無(wú)害化治理技術(shù)，不合理使用化學(xué)農(nóng)藥，造成農(nóng)藥污染和藥品殘留超標(biāo)，并引發(fā)病菌的耐藥問(wèn)題，嚴(yán)重影響了杭白菊的安全衛(wèi)生質(zhì)量，也在一定程度上影響了其藥理品質(zhì)，更成為制約杭白菊產(chǎn)業(yè)健康持續(xù)發(fā)展和出口創(chuàng)匯的重要障礙。因此，對(duì)杭白菊主要病害的病原菌鑒定、致病機(jī)制及防治策略的系統(tǒng)研究迫在眉睫。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)所用杭白菊染病植株和健康植株均于2014年6月采集自杭州桐鄉(xiāng)地區(qū)。Taq DNA polymerase購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司;PCR產(chǎn)物克隆試劑盒購(gòu)自生工生物工程 (上海)股份有限公司;其余常用化學(xué)試劑均由浙江省藥用植物種質(zhì)改良與質(zhì)量控制技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 方法

1.2.1 致病真菌的分離純化

將處理過(guò)的表現(xiàn)葉枯癥狀的杭白菊枝葉植入PDA培養(yǎng)基平板中，每皿植入4～5塊，用封口膜密封，置25℃培養(yǎng)箱中黑暗倒置培養(yǎng)［5］。每隔12 h觀察1次，待莖、葉切面處長(zhǎng)出菌絲后，挑尖端部分移至新的PDA平板上，25℃黑暗培養(yǎng)，經(jīng)反復(fù)傳代純化后，即得到致病真菌純培養(yǎng)物，并于PDA斜面4℃保存。

1.2.2 致病菌形態(tài)鑒定

將分離純化后的菌接種到PDA平板上培養(yǎng)，記錄分離菌落培養(yǎng)的大小、形態(tài)、顏色、色素分泌、產(chǎn)孢等性狀及菌絲孢子形態(tài)。

1.2.3 菌株分子鑒定

收集純培養(yǎng)真菌菌絲，采用Lysis法提取基因組DNA［6］并檢測(cè)，以此DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增(引物為 ITS1(5＇-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3＇)和 ITS4(5＇-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3＇))及測(cè)序分析，獲得的真菌ITS序列提交到GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST同源檢索，得到相對(duì)應(yīng)的同源基因序列，明確所測(cè)菌株的分類地位［7］。

1.2.4 致病性測(cè)定

將活化后的致病菌菌絲接種到PDB液體培養(yǎng)基中，25℃下170 r·min-1培養(yǎng)2～3 d，獲得大量真菌孢子。將真菌孢子稀釋成不同濃度梯度 (104，106，108spores·mL-1)，接種于健康無(wú)病的杭白菊葉片上，在適宜的濕度和溫度 (20，25，30℃)下培養(yǎng)。每24 h觀察記錄葉片的發(fā)病癥狀，并以等劑量的ddH2O作為空白對(duì)照［8］。待葉片表現(xiàn)癥狀后對(duì)病斑進(jìn)行組織分離，鑒定分離病菌是否與原始病菌相同。

2 結(jié)果與分析

2.1 致病菌形態(tài)鑒定

從表現(xiàn)葉枯癥狀的杭白菊枝葉中共分離純化獲得26個(gè)菌株。將菌株分別接種到PDA平板上培養(yǎng)4～5 d，記錄菌落形態(tài)。觀察發(fā)現(xiàn)，所分離到的菌株菌落呈白色棉絮狀，菌絲飽滿致密，幾乎布滿整個(gè)平板 (圖1)。同時(shí)，挑取平板內(nèi)的菌絲，制成臨時(shí)裝片，熒光顯微鏡下觀察菌絲及孢子形態(tài)。鏡檢觀察菌絲細(xì)胞質(zhì)均勻，直長(zhǎng)少分支，節(jié)間較長(zhǎng)，并有大量鐮刀形的小型分生孢子 (圖2)。

2.2 致病菌分子鑒定

隨機(jī)選擇部分菌株，擴(kuò)增獲得真菌rDNA ITS區(qū)段約500 bp。擴(kuò)增獲得的片段經(jīng)PCR產(chǎn)物純化

圖2 菌絲及孢子形態(tài)

圖1 菌落形態(tài)后送公司測(cè)序，經(jīng)序列分析后得到各菌株ITS序列(圖 3)。將測(cè)序獲得的真菌 ITS序列提交到GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST同源檢索，得到同源基因序列，進(jìn)行進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，所得致病菌與尖孢鐮刀菌 (Fusariam oxysporum)同源性最高，為同一屬真菌 (圖4)。

2.3 致病性測(cè)定

測(cè)定不同溫度和濃度條件下病原菌的致病性發(fā)現(xiàn)，接種溫度20℃、孢子濃度為108spores·mL-1時(shí)發(fā)病最為嚴(yán)重。接種2～3 d后，葉片先端變黃，再由局部擴(kuò)展到整個(gè)葉緣，呈褐色至紅褐色的葉緣病斑。其后病斑逐漸向葉片基部蔓延，直至整個(gè)葉片變?yōu)楹稚蚧液稚?］。病斑與健康組織交界明顯，病斑邊緣呈波紋狀，顏色較深，外緣部分可見(jiàn)鮮黃色線帶。最后病斑明顯增大，擴(kuò)散邊緣出現(xiàn)參差不齊的現(xiàn)象，病健組織的界限不明顯 (圖5)。

圖3 ITS序列

圖4 真菌ITS序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

3 小結(jié)與討論

圖5 致病性測(cè)定

目前針對(duì)杭白菊的病害研究工作多停留在病害癥狀的介紹上［10-11］。本試驗(yàn)從表現(xiàn)葉枯癥狀的杭白菊枝葉中共分離獲得真菌菌株26株，采用詳細(xì)的形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)方法，鑒定其為尖孢鐮刀菌(F．oxysporum)。將致病菌孢子重新接種回健康葉片，經(jīng)一段時(shí)間后表現(xiàn)出葉枯病癥狀，完成科赫氏法則驗(yàn)證，確定所分離得到的尖孢鐮刀菌確實(shí)為杭白菊葉枯病致病菌。此前一些研究認(rèn)為，菊花葉枯病由半知菌亞門菊殼針孢 (Septoria chrysantheme Ua Sacc.)侵染所致，初期葉片上出現(xiàn)圓形或橢圓形大小不一的紫褐色病斑，病斑周圍褪綠，中部呈灰白色，后期出現(xiàn)黑色小點(diǎn)，逐漸擴(kuò)展致葉片枯死［11］，而尖孢鐮刀菌多引起根腐?。?1-12］。本研究則證實(shí)尖孢鐮刀菌也是引起杭白菊葉枯病的元兇之一，擴(kuò)大了杭白菊葉枯病病原菌范圍，在生產(chǎn)中應(yīng)引起重視并加以合理的管理。

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