辛媛媛 張 艷 王松雪 吳 宇 賀小蔚

(國家糧食局科學研究院，北京 100037)

玉米是我國主要的糧食作物，由于含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，在田間和儲存過程中常受到多種真菌的污染而產(chǎn)生真菌毒素，例如鐮刀菌產(chǎn)生脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)、玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEN)和伏馬毒素(Fumonisins，F(xiàn)Bs)，黃曲霉產(chǎn)生黃曲霉毒素(Aflatoxins，AFs)。歐盟已制定了玉米中DON、ZEN、AFs、FBs、赭曲霉毒素(OTA)、T －2和 HT －2 等真菌毒素的法規(guī)限量和推薦限量［1－2］，我國食品安全國家標準規(guī)定玉米原糧中DON限量為1 000μg/kg，ZEN限量為60μg/kg，黃曲霉毒素 B1(AFB1)限量為20 μg/kg，OTA 限量為5 μg/kg［3］。

相比較基于免疫技術的色譜和光譜法，液相色譜質(zhì)譜法(LC－MS)具有更高的靈敏度和選擇性，可以進行多種毒素同時確證和精確定量［4－5］。Berthiller等［6］使用MycoSep 226多功能凈化柱建立了同時檢測玉米中單端孢霉烯族毒素和ZEN的LC－MS方法。Lattanzio等［7］使用2次溶劑提取和六合一多毒素免疫親和柱凈化的方法建立同時檢測DON、ZEN、AFs、FBs、OTA、T－2和 HT－2等真菌毒素的方法。由于毒素理化性質(zhì)差異較大，凈化不可避免造成某些毒素的損失，例如MycoSep 226多功能凈化柱吸附FBs、糖苷化DON和OTA等毒素［8］，而六合一免疫親和柱柱容量有限、價格昂貴、對操作者要求高，推廣應用受到一定限制。

近年來，超高壓液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀(UPLCMS/MS)使用高柱效的亞微米級填料色譜柱和高靈敏度、高選擇性的串聯(lián)質(zhì)譜檢測器，大大提高了真菌毒素檢測靈敏度，在滿足限量標準對定量限要求的前提下，可以將提取液稀釋后直接注入LC－MS儀器進行檢測，有效避免了凈化過程中目標物的損失，減少對特殊材料的依賴，實現(xiàn)多種毒素同時快速檢測。本試驗采用UPLC－MS/MS法，通過優(yōu)化提取溶劑和色譜質(zhì)譜條件降低基質(zhì)干擾，建立了一種不需要使用特殊凈化材料可快速準確測定玉米中DON及其乙?；苌?、ZEN、AFs、FBs、OTA、T －2 和 HT －2等13種重要真菌毒素的方法。

1 試驗方法

1.1 材料與試劑

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)、3#乙酰基脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(3#AcDON)、15#乙酰基脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(15#AcDON)、T#2毒素(T#2)、HT#2毒素(HT#2)、玉米赤霉烯酮(ZEN)、赭曲霉毒素 A(OTA)、黃曲霉毒素 B1(AFB1)、黃曲霉毒素 B2(AFB2)、黃曲霉毒素 G1(AFG1)、黃曲霉毒素 G2(AFG2)、伏馬毒素B1(FB1)、伏馬毒素B2(FB2):奧地利Biopure公司和美國Sigma公司;甲醇、乙腈(色譜純):Fisher公司;乙酸銨、甲酸、乙酸:Sigma公司;0.2$m PTFE膜針頭過濾器:PALL公司。

1.2 儀器與設備

ACQUITY UPLC超高壓液相色譜儀:美國Waters公司;TSQ QUANTUM ULTRA四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀:美國Thermo Fisher Scientific公司;3－30K離心機:美國Sigma公司;GT10－1高速臺式離心機:北京時代北利離心機有限公司;Roto－Shake Genie多用途旋轉(zhuǎn)搖床:美國Scientific Industries公司。

1.3 標準溶液配制

AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、OTA 分別用乙腈配制成1 mg/L的標準儲備液，3－AcDON、15－AcDON、HT－2、ZEN分別用乙腈配制成40 mg/L的儲備液，DON用甲醇配制成100 mg/L的儲備液，T－2用乙腈配制成10 mg/L儲備液，F(xiàn)B1、FB2用乙腈∶水(1∶1，V/V)配制成40 mg/L的標準儲備液。標準儲備液均于#20%C保存。

將上述各毒素標準儲備液用乙腈稀釋成濃度如下的混合標準溶液，其中:AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、OTA為0.1 mg/L，DON 為10 mg/L，3#AcDON 為4 mg/L，15#AcDON、ZEN、FB1、FB2為 2 mg/L，T#2 為0.2 mg/L，HT－2為1 mg/L。使用前將混合標準溶液用乙腈∶水(40∶60，V/V)或空白玉米提取液(按照1.4制備)進行逐級稀釋，配制成不同濃度的凈溶液標準工作液和基質(zhì)匹配標準工作液，備用。

1.4 樣品前處理

樣品經(jīng)粉碎(90%通過40目篩)混勻后，稱取5.00 g，加入 20 mL 乙腈∶水∶乙酸(80∶19∶1，V/V/V)混合溶劑，渦旋混勻1 min，振蕩30 min。然后4 000 r/min離心10 min使固液分離。準確轉(zhuǎn)移0.5 mL上清液于1.5 mL離心管中，加入0.5 mL超純水稀釋，渦旋混勻1 min，然后12 000 r/min離心10 min，取上清液用0.22μm的PTFE濾膜過濾，待測。

1.5 儀器條件

色譜條件:色譜柱，Agilent ZORBAX Eclipse XDB C18柱(100 mm ×2.1 mm，1.8$m);流速，0.25 mL/min;柱溫，30%C;進樣量，5$L;流動相，A相為甲醇，B相為含0.1%甲酸和0.5 mM乙酸銨的水溶液;洗脫條件，0～1 min 20%A，1～10 min 20%～35%A，10～16 min 35%～95%A，16～20 min 95%A，20～20.1 min 95%～20%A，20.1～24 min 20%A。

質(zhì)譜條件:離子源，ESI源;質(zhì)譜掃描方式，選擇反應監(jiān)測模式(SRM)，正負切換;噴霧電壓，3.0 kV(+)/2.5 kV(－);加熱氣溫度，100℃;鞘氣流速，40 L/h;輔助氣流速，20 L/h;離子傳輸毛細管溫度，350℃;碰撞氣為氬氣，碰撞壓力為1.5 mTorr;質(zhì)譜掃描循環(huán)時間0.7 Sec。各真菌毒素質(zhì)譜條件、母離子及定量、定性子離子見表1。

表1 13種真菌毒素質(zhì)譜條件

2 結(jié)果與討論

2.1 儀器條件的優(yōu)化

色譜柱的選擇 液相檢測真菌毒素一般使用反相C18色譜柱，試驗對比了Waters BEH C18柱(100 mm ×2.1 mm，1.7$m)、Waters HSST3柱(100 mm ×2.1 mm，1.7$m)和 Agilent ZORBAX Eclipse XDB C18(100 mm×2.1 mm，1.8$m)3種亞微米級粒徑的色譜柱對13種真菌毒素的分離效果。結(jié)果表明，大多數(shù)毒素在3種色譜柱上都能實現(xiàn)較好的分離，即使不能實現(xiàn)基線分離的毒素，由于母離子和子離子不同亦不影響定性和定量。其中DON的乙?；x產(chǎn)物3－AcDON和15－AcDON為同分異構(gòu)體，具有相似的分子結(jié)構(gòu)，選擇［M+H］+母離子339經(jīng)碰撞后兩者都同時存在 m/z為231、203、213、321、137、261的子離子，只是相對豐度不同，2個分子之間存在“Cross talk”效應，影響質(zhì)譜準確定性定量。為了準確鑒定3－AcDON和15－AcDON這2種鐮刀菌毒素的化學分型，應在色譜上實現(xiàn)兩者分離。試驗表明，在較短的梯度洗脫時間內(nèi)，使用BEH C18和HSST3色譜柱，3－AcDON和15－AcDON幾乎完全重合，而XDB C18柱能較好的分離2種同分異構(gòu)體，分離度R可達0.9(見圖1)，因此選用 Eclipse XDB C18色譜柱。

流動相的選擇 對比甲醇、乙腈為強洗脫流動相和含有不同比例的甲酸、乙酸、乙酸銨的水溶液為弱洗脫流動相對13種真菌毒素保留時間以及質(zhì)譜響應的影響。結(jié)果表明，甲醇為強洗脫流動相，含有0.1%甲酸的0.5 mM NH4Ac的水相為弱洗脫流動相，各毒素具有較高的靈敏度和穩(wěn)定的質(zhì)譜響應。質(zhì)譜條件的選擇 在上述優(yōu)化流動相條件下，使用ESI源分別優(yōu)化13種毒素的母離子、透鏡電壓、碰撞能量、1個定量子離子和2個定性子離子，各毒素的質(zhì)譜參數(shù)請見表1。

圖1 SRM模式下，13種真菌毒素的總離子流(TIC)疊加圖

2.2 樣品提取溶劑的優(yōu)化

提取溶劑對回收率的影響 目前糧食中真菌毒素的提取主要選擇甲醇、乙腈、水、酸以不同比例混合作為提取溶劑［9－10］，試驗對比了甲醇∶水(75∶25，V/V)、乙腈∶水(50∶50)、乙腈∶水(75∶25)、乙腈∶水∶乙酸(75∶24∶1)、乙腈:水(80∶20)、乙腈∶水∶乙酸(80∶19∶1)、乙腈∶水(84∶16)作為提取溶劑對 13 種毒素回收率的影響。采用基質(zhì)匹配外標法定量結(jié)果表明，除了FB1和FB2，其他毒素回收率均在70%～120%之間。FB1和FB2的回收率在乙腈∶水(50∶50)中最高，為100%左右。隨著提取溶劑中乙腈比例的提高，F(xiàn)B1和FB2的回收率逐漸降低，在乙腈∶水(84∶16)提取溶劑中回收率僅為40%。試驗中還發(fā)現(xiàn)在乙腈∶水的提取溶劑中加入少量乙酸可以顯著提高FB1和FB2的回收率。Beltran等［11］也得到相同的結(jié)論，這可能與FBs結(jié)構(gòu)中含有多個羧基，具有一定親水性和酸性有關。

提取溶劑對質(zhì)譜響應的影響 試驗重點對比了毒素回收率較高的甲醇∶水(75∶25)、乙腈∶水(50∶50)、乙腈∶水∶乙酸(75∶24∶1)、乙腈∶水∶乙酸(80∶19∶1)4 種提取溶劑對玉米基質(zhì)的影響。從外觀看，乙腈水混合提取液呈黃色，經(jīng)凈化后顏色變淺;而甲醇水提取液雖然外觀看色素較少，但在使用0.22$m PTFE濾膜過濾時有較大的阻力，這可能是由于甲醇水提取液中含有較多大分子蛋白。使用4種玉米空白基質(zhì)配制相同濃度的基質(zhì)匹配標準溶液進行質(zhì)譜檢測。多數(shù)真菌毒素在甲醇∶水(75∶25)玉米基質(zhì)中響應最低，在乙腈∶水∶乙酸(80∶19∶1)玉米基質(zhì)中響應最高。進一步采用ESI(+)全掃描(m/z 150～900)方式對4種空白玉米基質(zhì)進行檢測。在保留時間1.5～4 min和 11～16 min的范圍內(nèi)，甲醇∶水(75∶25)和乙腈∶水(50∶50)的空白玉米基質(zhì)本底較高，而乙腈∶水∶乙酸(80∶19∶1)的空白玉米基質(zhì)本底最低，對毒素離子化效率的干擾最小，因此選擇乙腈∶水∶乙酸(80∶19∶1)混合溶劑作為提取液。

2.3 基質(zhì)效應

試驗采用基質(zhì)匹配標準曲線斜率與凈溶液標準曲線斜率的比值來評估基質(zhì)對真菌毒素質(zhì)譜響應的抑制或增強效應(Signal Suppression/Enhancement，SSE)。13種毒素在玉米提取液中的基質(zhì)效應見表2，其中 AFG2、AFG1、AFB2、AFB1和 ZEN 的響應受到較強的抑制作用SSE%在31%～67%之間，F(xiàn)B1表現(xiàn)為基質(zhì)增強效應 SSE%為127%，DON、3－AcDON、15－AcDON、HT－2、T －2、OTA、FB2受基質(zhì)效應的影響較小SSE%在88%～112%之間。與文獻［12］報道毒素在玉米中的基質(zhì)效應相比，除了ZEN，本試驗所建立方法中毒素的基質(zhì)效應均顯著低于文獻的方法。

表2 玉米中13種真菌毒素的線性范圍、相關系數(shù)、檢出限、定量限和基質(zhì)效應

2.4 方法學驗證

采用空白基質(zhì)液逐級稀釋方法獲得各真菌毒素的檢出限(LOD，S/N≥3)和定量限(LOQ，S/N≥10)。表2列出了13種真菌毒素的線性范圍、檢出限和定量限。在各自的線性范圍內(nèi)，13種真菌毒素線性關系良好，相關系數(shù)(R2)均大于0.99，LOD和LOQ均低于歐盟和我國規(guī)定的糧食中真菌毒素限量標準，滿足限量檢測的要求。

取空白玉米樣品，分別添加3個濃度水平的混合標準溶液，按“1.4”樣品處理方法進行處理，每個加標水平進行6次重復實驗，回收率結(jié)果見表3。13種真菌毒素3個添加水平回收率在80%&114%之間，相對標準偏差在0.9%&10.9%之間，符合歐盟法規(guī)的要求［13］。

表3 玉米中13種真菌毒素的加標回收率(n=6)

為了進一步驗證方法的準確度和適用性，對真菌毒素的玉米粉基體標準物質(zhì)進行測定。如表4所示，9種毒素的檢測值均在標準值±不確定度的范圍內(nèi)，表明本研究所建立的方法準確可靠。

表4 對玉米粉基體標準物質(zhì)的檢測結(jié)果

3 結(jié)論

采用UPLC－MS/MS方法建立了玉米中13種真菌毒素的檢測方法，樣品經(jīng)過提取、稀釋、離心和過濾等簡單凈化過程即可進樣檢測，通過優(yōu)化提取溶劑和儀器條件有效降低基質(zhì)干擾。采用加標回收法和測定基體標準物質(zhì)驗證了方法的準確度和精密度，方法定量限在1～200μg/kg之間，滿足國內(nèi)外對糧食中真菌毒素限量的要求。與其他真菌毒素檢測方法相比，本試驗的方法快速簡單，不需要使用特殊的凈化材料，適合實驗室進行批量樣品準確測定。

［1］Commission Regulation(EC)No 1881/2006，setting maximum levels for certain contaminants in food stuffs［S］

［2］Commission Recommendation of 27 March 2013 on the presence of T －2 and HT －2 toxin in cereals and cereal products［S］

［3］GB2761—2011，食品安全國家標準食品中真菌毒素限量［S］

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［13］Commission Regulation(EU)No 519/2014，Amending Regulation(EC)No 401/2006 as regards methods of sampling of large lots，spices and food supplements，performance criteria for T－2，HT－2 toxin and citrinin and screening methods of analysis［S］.