于 淼，趙自云，劉成玉，牟曉峰

（1青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院，山東 青島 266021；2青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，山東 青島 266021）

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillinresistantStaphylococcusaureus，MRSA）是臨床上引起鼻腔、口腔黏膜、皮膚和上皮組織的感染，并導(dǎo)致炎癥化膿的重要病原菌之一。目前，MRSA按來(lái)源分為社區(qū)獲得性 MRSA（community-acquired MRSA，CA-MRSA）和醫(yī)院獲得性 MRSA（hospitalacquired MRSA，HA-MRSA）。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者致力于MRSA毒力因子的研究，發(fā)現(xiàn)一種稱為酚溶調(diào)制肽（phenol soluble modulin，PSM）的新型毒力因子。PSM最初由Mehlin等人從表皮葡萄球菌UW-3株的培養(yǎng)液上清中分離，包括由染色體基因組編碼的 PSM-α、PSM-β、PSM-γ，以及由位于可移動(dòng)遺傳元件SCCmec上的psm-mec基因編碼的PSM-mec［1］。研究［2-3］表明，CA-MRSA 菌株可以分泌PSM-α、PSM-β和PSM-γ，而 HA-MRSA菌株只能分泌PSM-β和PSM-γ，PSM-α和PSM-γ能夠溶解中性粒細(xì)胞和紅細(xì)胞等，而PSM-β則缺乏這一活性。本研究采用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）方法檢測(cè)本地區(qū)CA-MRSA和HA-MRSA菌株中PSM-α基因的分布，并通過(guò)細(xì)胞形態(tài)學(xué)方法來(lái)觀察PSM-α對(duì)人外周血中性粒細(xì)胞的溶解作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來(lái)源 90株不重復(fù) MRSA菌株分離自青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院及周邊醫(yī)院住院和社區(qū)患者的各種標(biāo)本，包括痰、血、膿液、糞便、傷口分泌物、口腔分泌物、導(dǎo)管、胸腔積液等。本實(shí)驗(yàn)室采用多重PCR方法對(duì)菌株SCCmecc型別進(jìn)行了鑒定，其中型別為 SCCmecⅢ 80 株（88.89%），SCCmecⅡ6株（6.67%），SCCmecⅤ2株（2.22%），SCCmecⅢ、SCCmecⅤ混合型2株（2.22%）。根據(jù)SCCmecⅠ、SCCmecⅡ、SCCmecⅢ型主要分布于HA-MRSA菌株中，SCCmecⅣ、SCCmecⅤ型主要分布 于 CA-MRSA 菌株中 的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn) 行 分 類［4-6］，90株MRSA菌株中 HA-MRSA86株，CA-MRSA 4株，質(zhì)控菌株為金黃色葡萄球菌ATCC25923。

1.1.2 主要儀器與試劑 超速低溫離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司，BIO-RAD梯度PCR儀購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD公司，BYCP-31PN電泳儀購(gòu)自北京六一儀器廠，GeIX1850型凝膠成像分析系統(tǒng)購(gòu)自上海歐祥科學(xué)儀器有限公司，數(shù)顯恒溫水浴箱購(gòu)自上海榮計(jì)達(dá)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司，普通光學(xué)顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司，BIOWEST AGAROSE G-10購(gòu)自西班牙。4%臺(tái)盼藍(lán)染液由本實(shí)驗(yàn)室配制，DNA提取液、TixTap酶及PCR反應(yīng)相關(guān)試劑、DL1000 DNA Marker、上樣緩沖液等試劑，均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司，人或各種動(dòng)物外周血中性粒細(xì)胞分離液試劑盒購(gòu)自天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司。

1.1.3 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù) GenBank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）公布的基因序列，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)合成引物，PSM-α基因上游引物序列為:ATGGGTATCATCGCTGGCATCATTAAAGTT，下游引物序列:TTTTGCGAAAATGTCGATAATTGCTTTGAT，產(chǎn)物大小為406 bp，由寶生物工程（大連）有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌基因組DNA提取 將冷凍菌株轉(zhuǎn)種于哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基上，于37℃培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)。取50μL DNA提取液于滅菌的EP管中，用滅菌吸頭挑取單菌落，置于EP管中混勻，80℃熱變性15 min后，100℃水浴20 min，10 000 r/min離心10 min，裂解后的上清液作為PCR反應(yīng)的模板。

1.2.2 擴(kuò)增PSM-α基因 PCR反應(yīng)體系為25μL，其中10×Buffer緩沖液2.5μL、dNTP2μL、TixTap酶0.15μL、MgCl22μL、上下游引物各1μL、DNA模板2μL、加滅菌去離子水補(bǔ)足25μL。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5 min，94℃變性35 s，60℃退火45 s，72℃延伸45 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。

1.2.3 PCR產(chǎn)物檢測(cè) PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，以DL1000 DNA Marker為相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，用凝膠成像分析系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果。

1.2.4 DNA測(cè)序 PCR擴(kuò)增陽(yáng)性產(chǎn)物送寶生物工程（大連）有限公司進(jìn)行序列測(cè)定，結(jié)果與Gen-Bank序列數(shù)據(jù)庫(kù)標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對(duì)分析。

1.2.5 中性粒細(xì)胞死亡率檢測(cè) 按照試劑盒操作說(shuō)明分離健康成人外周靜脈血（EDTA-K2抗凝）中性粒細(xì)胞，重懸培養(yǎng)液中。取4份體積均為100μL的中性粒細(xì)胞懸液，分別加入30μL的0.5麥?zhǔn)蠁挝坏腜SM-α陽(yáng)性 MRSA菌液、0.5麥?zhǔn)蠁挝坏腜SM-α陰性 MRSA菌液、0.5麥?zhǔn)蠁挝坏腁TCC 25923菌液、生理鹽水，充分混勻，放入培養(yǎng)箱孵育3 h后，用臺(tái)盼藍(lán)染液染色并在顯微鏡下計(jì)數(shù)中性粒細(xì)胞死亡率。計(jì)算公式:死亡率（%）＝染色細(xì)胞數(shù)/（未染色細(xì)胞數(shù)＋染色細(xì)胞數(shù)）×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，將數(shù)據(jù)進(jìn)行反正弦轉(zhuǎn)換后進(jìn)行單因素方差分析，P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MRSA菌株P(guān)SM-α攜帶情況 86株 HA-MRSA中PSM-α基因陽(yáng)性78株，陽(yáng)性率為90.70%；4株CA-MRSA中，2株P(guān)SM-α基因陽(yáng)性，陽(yáng)性率為50.00%。PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖1。

圖1 PSM-α基因的PCR產(chǎn)物電泳圖Figure 1 Electrophoresis map of PCR product of PSM-α gene

2.2 基因測(cè)序結(jié)果 測(cè)序結(jié)果與GenBank序列數(shù)據(jù)庫(kù)標(biāo)準(zhǔn)序列（JQ066321.1）比對(duì)，結(jié)果完全一致。2.3 中性粒細(xì)胞死亡率 MRSAPSM-α陽(yáng)性組中性粒細(xì)胞死亡率與生理鹽水組、PSM-α陰性組、ATCC25923組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.001），PSM-α陽(yáng)性組死亡率高于其他3 組，而PSM-α陰性組和ATCC25923組差異，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.886），見表1。PSM-α陽(yáng)性組與PSM-α陰性組對(duì)細(xì)胞的毒性結(jié)果見圖2～3。

表1 MRSAPSM-α使中性粒細(xì)胞死亡情況的比較（±s，%）Table 1 Comparison of neutrophil death induced by MRSAPSM-α（±s，%）

表1 MRSAPSM-α使中性粒細(xì)胞死亡情況的比較（±s，%）Table 1 Comparison of neutrophil death induced by MRSAPSM-α（±s，%）

Note:＊ Compared with PSM-α positive group，P＝0.001；＃:Compared with PSM-αnegative group，P＝0.886

ecimen Death rate PSM-αpositive Group Sp 50 68±12 PSM-αnegative 50 56±10＊ATCC25923 50 56±11＊＃Normal saline 50 40±10＊

圖2 MRSA PSM-α基因陽(yáng)性組細(xì)胞毒性結(jié)果Figure 2 Results of cytotoxicity in PSM-αgene positive MRSA group

圖3 MRSA PSM-α基因陰性組細(xì)胞毒性結(jié)果Figure 3 Results of cytotoxicity in PSM-αgene negative MRSA group

3 討論

自2000年美國(guó)報(bào)道CA-MRSA以來(lái)，越來(lái)越多的研究者致力于其高致病力機(jī)制的研究［7］。研究［2-3］發(fā)現(xiàn)，在鼠膿腫和菌血癥模型中PSM-α基因缺失菌株的毒力弱于野生型菌株，并證實(shí)了PSM-α能夠刺激并溶解人的中性粒細(xì)胞，最終破壞人體應(yīng)對(duì)金黃色葡萄球菌感染的細(xì)胞免疫防御系統(tǒng)，認(rèn)為CA-MRSA菌株的高毒力是由于其可以分泌具有溶解中性粒細(xì)胞活性的PSM-α，而HA-MRSA則不能分泌PSM-α。本研究中，86株 HA-MRSA 中PSM-α基因陽(yáng)性78株，陽(yáng)性率為90.70%，這與國(guó)外研究［2-3，8］的結(jié)果不同，可能因?yàn)閲?guó)內(nèi)臨床治療中抗菌藥物的濫用，導(dǎo)致HA-MRSA菌株毒力增強(qiáng)，但具體原因有待進(jìn)一步研究。本研究檢測(cè)到的CA-MRSA菌株過(guò)少，無(wú)法進(jìn)行HA-MRSA和CA-MRSA菌株中PSM-α陽(yáng)性率差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

中性粒細(xì)胞是機(jī)體免疫防御系統(tǒng)的第一道防線，通過(guò)吞噬作用識(shí)別并攝取病原體，隨后產(chǎn)生活性氧或脫顆粒作用殺傷病原體，起到局部控制感染的作用［9］。分泌PSM-α的MRSA菌株被中性粒細(xì)胞吞噬后，PSM-α可以促進(jìn)中性粒細(xì)胞的胞內(nèi)溶解，延緩細(xì)胞凋亡，使病原菌大量存活，最終逃脫中性粒細(xì)胞的殺傷作用，導(dǎo)致疾病的發(fā)生［10-11］，但 PSM-β不能在這一過(guò)程中發(fā)揮作用［12］。

為進(jìn)一步了解本地區(qū)分離的HA-MRSA所分泌的PSM-α是否也具有促進(jìn)中性粒細(xì)胞溶解的活性，本研究比較PSM-α基因陽(yáng)性菌株和陰性菌株對(duì)人中性粒細(xì)胞的影響，結(jié)果表明分泌PSM-α的MRSA對(duì)中性粒細(xì)胞的溶解作用高于不分泌PSM-α的MRSA，而不分泌PSM-α的MRSA與ATCC25923的溶解作用無(wú)差異。

綜上所述，本研究有助于我們進(jìn)一步了解MRSA菌株能夠逃脫中性粒細(xì)胞殺傷作用的機(jī)制，為臨床尋找治療MRSA感染的新途徑及金黃色葡萄球菌疫苗的制備提供了理論依據(jù)。

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