孫淼，李嶺，李啟紅，李慧姣，李俊平，楊承槐

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

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雞傳染性支氣管炎病毒M41株毒種保存期試驗(yàn)

孫淼，李嶺，李啟紅，李慧姣，李俊平*，楊承槐*

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

對保存于中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心的4個(gè)不同年代(1991年4月、1996年6月、2001年1月、2006年12月)凍干的雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)M41株毒種進(jìn)行了對雛雞的毒力和病毒含量測定試驗(yàn)，結(jié)果表明：4個(gè)不同保存年代的IBV M41株毒種均能使雛雞100%出現(xiàn)雞傳染性支氣管炎典型癥狀，病毒含量均≥106.0EID50/0.1 mL。其中一支毒種在-70 ℃以下保存22年11個(gè)月，其毒力和病毒含量均符合《中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程》(二〇〇〇年版)規(guī)定，能夠滿足檢驗(yàn)需求。本試驗(yàn)為探尋IBV M41株毒種更加合理的保存期提供了參考。

雞傳染性支氣管炎病毒；M41株；毒力；保存期

雞傳染性支氣管炎(Avian Infectious Bronchitis, IB)是由雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)引起的一種急性、高度接觸傳染性呼吸道疾病[1]。該病典型的癥狀表現(xiàn)為喘氣、咳嗽、打噴嚏、氣管啰音、流鼻液等。疫苗免疫是當(dāng)前預(yù)防和控制雞傳染性支氣管炎的主要措施[2]，疫苗的質(zhì)量是影響免疫效果最重要的一環(huán)，國內(nèi)外有多種針對不同致病型或血清型的疫苗毒株和疫苗效力評價(jià)用強(qiáng)毒株。雞傳染性支氣管炎病毒M41株既可作為雞傳染性支氣管炎滅活疫苗的生產(chǎn)用毒種，又是檢驗(yàn)用強(qiáng)毒株。二〇〇〇年版《中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程》[3](簡稱《獸用生物制品規(guī)程》)中規(guī)定，IBV M41株在-70 ℃以下，保存期為4年。生產(chǎn)用毒種及檢驗(yàn)用強(qiáng)毒的純凈性和毒力是影響疫苗質(zhì)量的關(guān)鍵性因素，而毒種的繁殖及鑒定不僅耗時(shí)費(fèi)力，還會(huì)增加污染機(jī)會(huì)。因此，制定更為合理的毒種保存期將提高工作效率、有效降低毒種污染外部病原微生物的風(fēng)險(xiǎn)。本實(shí)驗(yàn)室利用4個(gè)不同年代(1991年4月、1996年6月、2001年1月、2006年12月)凍干的IBV M41株毒種進(jìn)行了對雛雞的毒力和病毒含量測定試驗(yàn)，以期為制定雞傳染性支氣管炎病毒M41株毒種更加合理的保存期提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 毒種 IBV M41株，病毒制品檢測室分別于1991年4月、1996年6月、2001年1月、2006年12月繁殖、凍干，檢定合格后交由中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心在-70 ℃條件下保存。

1.1.2 SPF雞和SPF雞胚 均購自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 對雛雞的毒力 每批凍干的毒種從-70 ℃冰箱中任取1支，按照《獸用生物制品規(guī)程》中對雛雞的毒力測定方法，分別按瓶簽注明的裝量用滅菌生理鹽水作10倍稀釋，各滴鼻接種4日齡SPF雛雞10只，每只0.05 mL，隔離飼養(yǎng)觀察10日，每日觀察接種雛雞是否出現(xiàn)雞傳染性支氣管炎典型癥狀。

1.2.2 病毒含量測定 每批凍干的毒種任取2支，分別用滅菌生理鹽水作10倍系列稀釋至10-7，取10-5、10-6、10-7三個(gè)滴度，各經(jīng)尿囊腔途徑接種10日齡SPF雞胚5枚，每胚接種0.1 mL，置37 ℃條件孵育，每日照蛋。孵育144 h后，取出所有雞胚，檢查雞胚胎兒病變。根據(jù)特異病變數(shù)，按Reed-Muench法計(jì)算EID50。

2 結(jié)果

2.1 對雛雞的毒力 不同保存年代的IBV M41株毒種對雛雞的毒力結(jié)果如表1所示。

表1 不同保存年代的雞傳染性支氣管炎病毒M41株對雛雞的毒力測定結(jié)果

由表1可以看出，在攻毒后第6日，4個(gè)保存年代的毒種均使接種雛雞100%發(fā)病，對雛雞的毒力仍符合《獸用生物制品規(guī)程》規(guī)定(至少應(yīng)有80%雛雞出現(xiàn)雞傳染性支氣管炎典型癥狀)。

2.2 病毒含量測定 不同保存年代的雞傳染性支氣管炎病毒M41株病毒含量測定結(jié)果如表2所示。可以看出，1991年4月(-70 ℃保存22年11個(gè)月)凍干保存的毒種病毒含量未下降；1996年6月(-70 ℃保存17年9個(gè)月)、2001年1月(-70 ℃保存13年2個(gè)月)和2006年12月(-70 ℃保存7年3個(gè)月)凍干保存的毒種病毒含量分別下降0.77、0.05和0.1個(gè)滴度，仍符合《獸用生物制品規(guī)程》規(guī)定。

表2 不同保存年代的雞傳染性支氣管炎病毒M41株病毒含量測定結(jié)果

3 討論與小結(jié)

在禽用活疫苗生產(chǎn)過程中，生產(chǎn)用毒種的質(zhì)量直接決定疫苗免疫效果的好壞。而檢驗(yàn)用強(qiáng)毒株作為成品效力檢驗(yàn)中的攻毒毒株，也對疫苗質(zhì)量的把控有重要意義。我國對不同獸用活疫苗的生產(chǎn)用毒種和檢驗(yàn)用強(qiáng)毒均制定了相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)，并要求生產(chǎn)企業(yè)嚴(yán)格遵照執(zhí)行，需要對毒種進(jìn)行諸如病毒含量、安全性、免疫原性、純凈性、特異性和毒力等檢驗(yàn)合格后方可進(jìn)行生產(chǎn)銷售。毒種的繁殖、制備、鑒定工作不僅會(huì)消耗一定的人力、物力和財(cái)力，還需要較長的時(shí)間，而且過程中還具有生物安全的潛在風(fēng)險(xiǎn)。因此，制定更為科學(xué)合理的毒種保存期很有必要。

吳濤等對-70 ℃條件下保存6年、12年、16年的新城疫病毒HB1株和-70 ℃條件下保存8年、14年、19年的新城疫病毒F株進(jìn)行了保存期試驗(yàn)，各毒種的病毒含量均未發(fā)生明顯變化，建議適當(dāng)延長HB1株和F株的保存期[4]。雞傳染性支氣管炎病毒在低溫保存時(shí)穩(wěn)定，雞胚尿囊液和細(xì)胞培養(yǎng)物中的病毒，可在-30～-60 ℃存活幾個(gè)月，而凍干真空密封的病毒在低溫下存活可達(dá)24年[1]。有報(bào)道稱，凍干的感染性尿囊液經(jīng)真空密封后置于冰箱中，至少可存放30年[2]。影響凍干種毒質(zhì)量的因素有很多，比如真空度、凍干保護(hù)劑、剩余水分等。

本研究中的IBV凍干種毒的真空度和剩余水分等指標(biāo)均符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，選用蔗糖-牛奶作為凍干保護(hù)劑有利于毒種的長期保存?！东F用生物制品規(guī)程》規(guī)定，雞傳染性支氣管炎病毒M41株毒種在-70 ℃以下，保存期為4年。本研究中，雞傳染性支氣管炎病毒M41株毒種保存22年11個(gè)月其對雛雞的毒力未減弱，均10/10發(fā)病，病毒含量均未明顯下降，仍符合《獸用生物制品規(guī)程》規(guī)定。該毒種在-70 ℃以下的保存期至少為22年11個(gè)月，建議在修訂規(guī)程時(shí)可適當(dāng)增加保存期。

[1] 殷震，劉景華. 動(dòng)物病毒學(xué)[M]. 第二版. 北京：科學(xué)出版社, 1997: 675-681.

[2] Saif Y M. 禽病學(xué)[M]. 第十二版. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2012: 129-151.

[3] 農(nóng)業(yè)部獸用生物制品規(guī)程委員會(huì).中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程(二〇〇〇年版)[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 2000: 212-214.

[4] 吳濤，毛婭卿，王嘉，等. 雞新城疫活疫苗種毒HB1株和F株保存期試驗(yàn)[J]. 中國獸藥雜志, 2011, 45(6): 13-15.

(編 輯：李文平)

Preservation Period Test of Master Seed Virus of Infectious Bronchitis Virus Strain M41

SUN Miao, LI Ling, LI Qi-hong, LI Hui-jiao, LI Jun-ping*, YANG Cheng-huai*

(ChinaInstituteofVeterinaryDrugControl,Beijing100081,China)

The virulence on chicks and virus titers of four batches of master seed virus of infectious bronchitis virus strain M41, stored at temperature of -70 ℃ in China Veterinary Culture Collection Center in different ages (1991.4, 1996.6, 2001.1, 2006.12) were tested. The results indicated that all of the chicks inoculated with four batches of virus showed the typical symptoms of avian infectious bronchitis. The virus titers were all above 106.0EID50/0.1mL. The virulence and virus titers of master seed virus of infectious bronchitis virus strain M41, stored at temperature of -70 ℃ for 22 years and 11 months, complied with the veterinary biological products regulation of the People’s Republic of China. The viruses meet the requirements of test. This laid the foundation of finding a more scientific preservation period of IBV strain M41.

infectious bronchitis virus; strain M41; virulence; preservation period

孫淼，從事動(dòng)物生物制品檢驗(yàn)及相關(guān)研究。

李俊平，E-mail: lijunping03@163.com；楊承槐，E-mail:ychenghuai@163.com

2015-04-16

A

1002-1280 (2015) 08-0007-03

S858.31