梁姣姣，居頌文，高志欣

（南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院北區(qū)：1．消化系疾病與營(yíng)養(yǎng)研究中心；2．消化科，蘇州215008）

調(diào)節(jié)性CD4＋CD25＋T（regulatory T，CD4＋CD25＋Treg）細(xì)胞是機(jī)體重要的負(fù)性免疫調(diào)節(jié)成分。Treg細(xì)胞約占外周CD4＋細(xì)胞的5%～10%，這類(lèi)細(xì)胞數(shù)量雖少但功能強(qiáng)大在機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)維持、腫瘤免疫等方面發(fā)揮著重要作用［1－5］。FOXP3在Treg細(xì)胞發(fā)育和功能中起關(guān)鍵作用，是CD4＋CD25＋Treg細(xì)胞特異性的標(biāo)記［6］。新近研究發(fā)現(xiàn)，健康人外周血T淋巴細(xì)胞中CD127和Foxp3的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，CD127可以識(shí)別CD4＋CD25＋Treg細(xì)胞與活化的T細(xì)胞，因此，根據(jù)細(xì)胞表面CD127表達(dá)，可將Treg細(xì)胞定義CD4＋CD25hiCD127low／－

Treg細(xì)胞［7－8］。Treg細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞間接觸依賴機(jī)制發(fā)揮作用或分泌IL－10和TGF－β1等細(xì)胞因子，抑制CD4＋CD25－T細(xì)胞、CD8＋T細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞等其他免疫細(xì)胞的活性和功能［5］。PD－L1是新發(fā)現(xiàn)的B7家族中的共刺激分子，PD－L1與T細(xì)胞表面的相應(yīng)配體PD－1結(jié)合，傳遞負(fù)反饋信號(hào)，抑制T細(xì)胞的激活和效應(yīng)應(yīng)答，腫瘤細(xì)胞表達(dá)的PD－L1能抑制細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）的抗腫瘤活性，從而逃避免疫攻擊［9－11］。而 PD－L1在腫瘤患者 CD4＋CD25hiCD127low／－Treg 細(xì)胞上的表達(dá)及臨床意義目前研究較少，本研究探討了結(jié)腸癌患者外周血中PD－L1在CD4＋CD25hiCD127low／－Treg細(xì)胞上的表達(dá)及其與腫瘤病理分期及患者荷瘤狀況之間的相關(guān)性。

1 資料與方法

1．1 一般資料 分別采集結(jié)腸癌患者血樣47份，其中男25份，女22份，年齡31～82歲，平均62．5歲，同時(shí)采集健康人血樣10份作對(duì)照，其中男5份，女5份，年齡26～80歲，平均49．2歲?；颊邩颖緛?lái)自南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院北區(qū)和蘇州大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院。所有患者樣本在化學(xué)治療、放射治療之前采集。

1．2 方法 采用聚蔗糖－泛影葡胺（Ficoll－Hypaque）密度梯度離心法從肝素全血中分離外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）。各種合適滴度的單克隆抗體與單細(xì)胞懸液在4℃條件下孵育染色20min。同時(shí)用同型對(duì)照的單克隆抗體孵育單細(xì)胞懸液，以判斷非特異性染色的程度。然后應(yīng)用FACSCalibur流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13．0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用x±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用率表示，組間采用χ2檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0．05，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2．1 結(jié)腸癌患者外周血中 CD4＋CD25hiCD127low／－Treg細(xì)胞上PD－L1的表達(dá) 結(jié)腸癌患者以及健康志愿者的PBMCs分別標(biāo)記抗不同的熒光抗體（CD4－FITC單抗、CD25－PECy5單抗、CD127－APC單抗、PD－L1－PE單抗，BD公司）。流式細(xì)胞術(shù)分析CD4＋CD25hiCD127low／－Treg細(xì)胞的含量及其PD－L1的表達(dá)。與健康志愿者比較，結(jié)腸癌患者的CD4＋CD25hiCD127low／－Treg細(xì)胞的百分含量明顯增加（P＜0．01），見(jiàn)圖1，且CD4＋CD25hiCD127low／－Treg細(xì)胞PD－L1分子的表達(dá)明顯上升（P＜0．01），見(jiàn)圖2。進(jìn)一步的分析表明，PD－L1分子在Ⅲ期和Ⅳ期患者CD4＋CD25hiCD127low／－Treg細(xì)胞上的表達(dá)明顯高于Ⅰ期和Ⅱ期患者，見(jiàn)圖3。

2．2 CD4＋CD25hiCD127low／－Treg PD－L1的表達(dá)與腫瘤患者的荷瘤狀況相關(guān)性 結(jié)腸癌患者手術(shù)前和手術(shù)后3周的PBMCs分別標(biāo)記 CD4－FITC單抗、CD25－PECy5單抗、CD127－APC單抗、PD－L1－PE單抗，流式細(xì)胞儀分析 CD4＋CD25hiCD127low／－Treg細(xì)胞上PD－L1的表達(dá)。研究結(jié)果表明，術(shù)后結(jié)腸癌患者CD4＋CD25hiCD127low／－Treg上PD－L1的表達(dá)較術(shù)前明顯下降（P＜0．05），見(jiàn)圖4。

圖1 結(jié)腸癌患者外周血中CD4＋CD25hi CD127low／－Treg細(xì)胞含量明顯增加

圖2 PD－L1分子在結(jié)腸癌患者外周血CD4＋CD25hi CD127low／－Treg中表達(dá)升高

圖3 PD－L1分子在不同分期結(jié)腸癌患者外周血CD4＋CD25hi CD127low／－Treg細(xì)胞中表達(dá)變化

圖4 手術(shù)后PD－L1分子在結(jié)腸癌患者外周血CD4＋CD25hi CD127low／－Treg中表達(dá)下降

3 討 論

諸多報(bào)道表明，Treg細(xì)胞的增加是導(dǎo)致腫瘤逃逸的重要因素。例如，在非小細(xì)胞肺癌和卵巢癌患者腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞中Treg的含量明顯增多［12－13］。在胃腸道腫瘤患者中CD4＋CD25－T細(xì)胞明顯減少而Treg細(xì)胞數(shù)量增多，且Treg細(xì)胞數(shù)量的增高與較差的預(yù)后和較低的生存率高度相關(guān)［14］。Treg數(shù)量的增加在頭頸部鱗癌、肝癌、多發(fā)性骨髓瘤等許多腫瘤患者中也均有報(bào)道［15－16］。本研究也證實(shí)，在結(jié)腸癌患者外周血中CD4＋CD25hiCD127low／－Treg細(xì)胞的百分含量明顯增加。進(jìn)一步的研究表明CD4＋CD25hiCD127low／－Treg細(xì)胞上PD－L1表達(dá)明顯升高。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，晚期患者PD－L1的表達(dá)水平明顯高于早期患者。手術(shù)后患者CD4＋CD25hiCD127low／－Treg細(xì)胞上PD－L1表達(dá)明顯降低。PD－L1分子在Treg細(xì)胞上的表達(dá)水平與腫瘤分期密切相關(guān)，隨著腫瘤的縮小或切除，PD－L1分子的表達(dá)水平會(huì)隨之不同程度下降，說(shuō)明PD－L1表達(dá)水平與腫瘤負(fù)荷相關(guān)。PD－L1是重要的免疫抑制分子，PDL1與PD－1結(jié)合后抑制T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞功能，從而介導(dǎo)腫瘤免疫逃逸。因此，本研究結(jié)果提示，PD－L1分子在CD4＋CD25hiCD127low／－Treg細(xì)胞上的表達(dá)水平升高可能導(dǎo)致了CD4＋CD25hiCD127low／－Treg細(xì)胞免疫抑制功能的提高，進(jìn)而增強(qiáng)了對(duì)其他免疫細(xì)胞的抗腫瘤能力的抑制，而隨著腫瘤的進(jìn)展PD－L1分子的表達(dá)水平隨之升高，CD4＋CD25hiCD127low／－Treg細(xì)胞的免疫抑制功能進(jìn)一步增強(qiáng)。因此，PD－L1分子在Treg細(xì)胞上表達(dá)水平的監(jiān)測(cè)對(duì)評(píng)價(jià)結(jié)腸癌治療效果、疾病進(jìn)展及預(yù)后具有重要價(jià)值。

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