史一君，郭 慶，安 威

（首都醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)系，肝臟保護(hù)與再生調(diào)節(jié)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100069）

肝臟是以代謝功能為主的人體最大臟器。在體內(nèi)扮演著消化、吸收、代謝，去除毒素和轉(zhuǎn)運(yùn)等多種重要角色。由于承擔(dān)著如此繁重的任務(wù)，肝臟很容易被各種致病因素攻擊。肝刺激因子（hepatic stimulator substance，HSS）是一種相對(duì)分子質(zhì)量為15～23 000的多肽類物質(zhì)，熱穩(wěn)定性強(qiáng)，無種屬特異性，但有器官特異性［1］。HSS存在于哺乳動(dòng)物的胚肝以及部分切除后的殘余肝臟中［2］。研究表明，HSS可以保護(hù)肝細(xì)胞免受如四氯化碳、氨基半乳糖和缺氧等毒性因素的損傷［3-4］。非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一種逐漸被人們認(rèn)識(shí)的慢性肝臟疾病，它是無過量飲酒史，以肝細(xì)胞脂肪變性為特征的臨床綜合征。NAFLD可謂為一個(gè)由輕到重的肝臟疾病譜，其病理過程包含3個(gè)發(fā)病階段，即單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）、終末期的肝纖維化／肝硬化［5］。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，HSS在蛋氨酸膽堿缺乏飼料飲食喂養(yǎng)的小鼠NASH中起到保護(hù)作用，可以減輕肝臟的脂肪堆積［6］。本研究旨在觀察油酸（oleic acid，OA）誘導(dǎo)BEL-7402細(xì)胞NASH疾病的細(xì)胞模型中，HSS是否可以減輕細(xì)胞中脂質(zhì)的堆積。而HSS對(duì)NASH疾病保護(hù)機(jī)制可能與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的鈣通道相關(guān)，這一部分的研究我們?nèi)栽谶M(jìn)一步探討中。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 BEL-7402細(xì)胞，人原發(fā)性肝癌細(xì)胞系，本實(shí)驗(yàn)室保存；DMEM培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco／BRL公司）；胎牛血清（美國(guó)Hyclone公司）；OA（美國(guó)Sigma公司）；噻唑藍(lán)［3-（4，5）-dimethylthiahiazo（-z-y1）-3，5-di-phenytetrazoliu-mromide，MTT］粉末（北京天來生物科技有限公司）；組織三酰甘油（triglyceride，TG）酶法測(cè)定試劑盒（北京普利來基因技術(shù)有限公司）；油紅 O（美國(guó)Sigma公司）；caspase-3／7活性檢測(cè)試劑盒（美國(guó)Promega公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 野生型BEL-7402細(xì)胞、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染空載體和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HSS的BEL-7402細(xì)胞在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中置于37℃含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每24～48h傳代1次，取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 MTT法測(cè)定細(xì)胞活力 BEL-7402細(xì)胞按2×104個(gè)細(xì)胞密度接種于96孔板中，在37℃含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直至細(xì)胞匯合達(dá)80%時(shí)，更換含有1%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞5h，以排除血清對(duì)細(xì)胞的影響。分別向培養(yǎng)基中加入牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）和濃度為25、50、100、200、400μmol／L的 OA培養(yǎng)24h。隨后，每孔加入50μL的2g／L的MTT溶液繼續(xù)培養(yǎng)3h。隨后，將培養(yǎng)基吸出，每孔加入150μL二甲基亞砜，避光條件下振蕩混勻10min。用酶標(biāo)儀在490nm下測(cè)光密度（optical density，OD）值。

1.4 細(xì)胞內(nèi)TG的測(cè)定 按照普利萊公司組織TG酶法測(cè)定試劑盒中說明書的步驟進(jìn)行操作，用酶標(biāo)儀在550nm工作波長(zhǎng)下測(cè)定OD值。

1.5 油紅O染色 配置0.5%油紅O儲(chǔ)存液，之后以3∶2的比例混合稀釋油紅O儲(chǔ)存液和雙蒸水，現(xiàn)用現(xiàn)配。待野生型BEL-7402，轉(zhuǎn)染空載體或轉(zhuǎn)染HSS的BEL-7402細(xì)胞匯合率達(dá)80%時(shí)，用中性甲醛固定細(xì)胞10min。用過濾后的油紅O染液染色10～15min。用60%異丙醇脫色細(xì)胞5s，之后用PBS漂洗細(xì)胞3次，使用蘇木精對(duì)細(xì)胞核復(fù)染10～20s［7］。

1.6 丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）的測(cè)定 應(yīng)用日立7180全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)基上清液中ALT的含量。

1.7 Caspase-3／7活性檢測(cè) 按照Promega公司caspase-3／7檢測(cè)試劑盒說明書的步驟操作，用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以±s表示，分別采用成組設(shè)計(jì)的t檢驗(yàn)、配對(duì)t檢驗(yàn)、F檢驗(yàn)和q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 MTT法檢測(cè)不同濃度OA對(duì)BEL-7402細(xì)胞活性的影響 用25、50、100、200、400μmol／L OA處理BEL-7402細(xì)胞24h后，用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性。細(xì)胞活力隨OA濃度升高而下降。當(dāng)OA濃度為200μmol／L時(shí)，與BSA對(duì)照組相比，細(xì)胞活力出現(xiàn)顯著下降；當(dāng)OA濃度為400μmol／L時(shí)，細(xì)胞活力下降更為顯著（圖1）。

圖1 MTT法檢測(cè)不同濃度OA處理BEL-7402細(xì)胞活力＊P＜0.05 ＃P＜0.01與BSA對(duì)照組比較（q檢驗(yàn)）Figure 1 The cell activity was determined by MTT treated with different concentrations of OA to BEL-7402cells

2.2 不同濃度OA對(duì)BEL-7402細(xì)胞內(nèi)TG含量的影響 用25、50、100、200、400μmol／L OA 分別處理BEL-7402細(xì)胞24h后，測(cè)定細(xì)胞內(nèi)TG的含量。與BSA組相比，隨OA濃度增加，細(xì)胞內(nèi)TG含量逐漸增加，直至OA濃度為100μmol／L時(shí)，細(xì)胞內(nèi)TG含量達(dá)到頂峰。當(dāng)OA濃度＞200μmol／L時(shí)，TG含量逐漸減少（圖2）。這可能與OA濃度＞200μmol／L時(shí)，細(xì)胞存活率顯著下降有關(guān)。

圖2 檢測(cè)不同濃度OA處理BEL-7402細(xì)胞內(nèi)TG的含量＊P＜0.05與BSA對(duì)照組比較（q檢驗(yàn)）Figure 2 The TG content in BEL-7402cells treated with different concentrations of OA

2.3 HSS對(duì)BEL-7402細(xì)胞內(nèi)TG含量的影響

用100μmol／L濃度OA作用于轉(zhuǎn)染空載體與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HSS的BEL-7402細(xì)胞24h，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)TG的含量。與空載體組相比，轉(zhuǎn)染HSS組細(xì)胞內(nèi)TG含量減少（圖3）。

2.4 HSS對(duì)BEL-7402細(xì)胞中脂滴堆積的影響

TG聚積在肝細(xì)胞內(nèi)會(huì)形成脂質(zhì)沉積。100μmol／L濃度的OA作用于轉(zhuǎn)染空載體與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HSS的BEL-7402細(xì)胞24h，用油紅O染色可以觀察到肝細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)堆積情況。轉(zhuǎn)染空載體細(xì)胞OA處理組，胞內(nèi)可見大量紅色顆粒，脂質(zhì)沉積明顯；穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HSS細(xì)胞與轉(zhuǎn)染空載體細(xì)胞相比，細(xì)胞內(nèi)紅色顆粒明顯減少，脂質(zhì)沉積減輕（圖4）。

圖3 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HSS可以減少TG在細(xì)胞內(nèi)的堆積＊P＜0.05與轉(zhuǎn)染空載體細(xì)胞的OA處理組比較（q檢驗(yàn)）Figure 3 The triglyceride content was significantly decreased in HSS-overexpressing cells

圖4 脂質(zhì)在BEL-7402細(xì)胞內(nèi)的定位，標(biāo)尺刻度均為50μm（油紅O染色 ×40）A.轉(zhuǎn)染空載體細(xì)胞BSA處理組油紅O染色；B.轉(zhuǎn)染空載體OA處理組油紅O染色；C.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HSS細(xì)胞BSA處理組油紅O染色；D.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HSS細(xì)胞OA處理組油紅O染色Figure 4 The lipid accumulation was determined in BEL-7402 cells.The scale bar indicates 50μm（oil red O staining×40）

2.5 HSS對(duì)BEL-7402細(xì)胞細(xì)胞膜通透性的影響轉(zhuǎn)染空載體OA處理組細(xì)胞，漏出胞外的ALT較BSA組明顯增多，而穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HSS可以顯著減少細(xì)胞ALT的漏出，見表1。

表1 2組細(xì)胞上清中ALT比較Table 1 The cellular supernatant levels of ALT in two groups（n=9，±s，U／L）

表1 2組細(xì)胞上清中ALT比較Table 1 The cellular supernatant levels of ALT in two groups（n=9，±s，U／L）

?

2.6 HSS對(duì)BEL-7402細(xì)胞凋亡的影響 用100 μmol／L濃度的OA作用于轉(zhuǎn)染空載體與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HSS的BEL-7402細(xì)胞24h，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)caspase-3／7的活性?？蛰d體OA處理組與BSA對(duì)照組相比，caspase-3／7的活性顯著增強(qiáng)，而穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HSS細(xì)胞的caspase-3／7活性顯著減弱（圖5）。

圖5 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HSS可以減輕細(xì)胞凋亡＊P＜0.05與轉(zhuǎn)染空載體的BSA處理組比較 ＃P＜0.05與轉(zhuǎn)染空載體的OA處理組比較（q檢驗(yàn)）Figure 5 The caspase-3／7activity was notably decreased in HSS-overexpressing cells

3 討 論

NAFLD是指除外酒精所致的一種慢性肝臟疾病，發(fā)病率日趨增長(zhǎng)，引起了學(xué)者們的關(guān)注和重視。對(duì)于NAFLD的發(fā)病機(jī)制，目前尚未完全明確，廣為認(rèn)可的是由英國(guó)學(xué)者Day提出的“二次打擊”學(xué)說。初次打擊是指胰島素抵抗和脂質(zhì)代謝紊亂所導(dǎo)致的肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積，形成了單純性脂肪肝；二次打擊是指在此基礎(chǔ)上其他各種原因所致的氧化應(yīng)激與脂質(zhì)過氧化損傷引起的肝細(xì)胞損傷乃至凋亡［8］。

對(duì)于NASH的發(fā)病，肝臟內(nèi)TG代謝紊亂是主要的發(fā)病原因。游離脂肪酸運(yùn)輸至肝臟過多，導(dǎo)致TG合成增多，肝臟脂肪蓄積。故本研究選用了OA不飽和脂肪酸誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞系BEL-7402建立體外NASH模型。使用不同濃度的OA處理BEL-7402細(xì)胞24h后，MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力，采用試劑盒測(cè)定細(xì)胞內(nèi)TG的含量。發(fā)現(xiàn)當(dāng)OA濃度達(dá)到100μmol／L時(shí)，細(xì)胞內(nèi)TG含量最多，細(xì)胞生存率高。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，加入外源性HSS蛋白可以促進(jìn)肝細(xì)胞增殖，甚至部分逆轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)性肝纖維化［9-10］。充分提示HSS是一個(gè)促進(jìn)肝細(xì)胞生長(zhǎng)的生長(zhǎng)因子，同時(shí)還能保護(hù)肝臟。本研究結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染了HSS的細(xì)胞內(nèi)TG含量明顯減少，用油紅O染色法觀察細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)堆積減輕。表明HSS對(duì)肝細(xì)胞脂質(zhì)損傷起到了保護(hù)作用。ALT主要存在于肝細(xì)胞的胞質(zhì)中，當(dāng)肝細(xì)胞受到損傷時(shí)，細(xì)胞膜通透性增加，大量ALT釋放入細(xì)胞外［11］。ALT是臨床上檢驗(yàn)肝功能是否受損的重要指標(biāo)。本研究中，檢測(cè)細(xì)胞漏出的ALT含量發(fā)現(xiàn)，OA可以誘導(dǎo)細(xì)胞分泌ALT增多，而轉(zhuǎn)染了HSS細(xì)胞中ALT含量比空載體組明顯減少。提示HSS可以維持細(xì)胞膜的通透性，使細(xì)胞免受脂質(zhì)損傷。OA誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生了細(xì)胞凋亡，而轉(zhuǎn)染HSS后，細(xì)胞凋亡減輕。說明HSS可以緩解肝細(xì)胞凋亡情況。

綜上所述，在BEL-7402細(xì)胞中穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HSS可以減少肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的蓄積，保護(hù)肝損傷，減輕肝細(xì)胞凋亡。而HSS對(duì)NASH的保護(hù)作用我們也在進(jìn)一步探索中，其可能機(jī)制為HSS通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激進(jìn)而減輕肝損傷。這為今后NASH的研究和防治提供了新的思路和依據(jù)。

［1］ LaBrecque DR， Pesch LA.Preparation and partial characterization of hepatic regenerative stimulator substance（SS）from rat liver［J］.J Physiol，1975，248（2）：273-284.

［2］ Sun GY，Dong LY，An W.Involvement of hepatic stimulator substance in the regulation of hepatoblast maturation into hepatocytes in vitro［J］.Stem Cells Dev，2014，23（14）：1675-1687.

［3］ Jiang SJ，Li W，An W.Adenoviral gene transfer of hepatic stimulator substance confers resistance against hepatic ischemia-reperfusion injury by improving mitochondrial function［J］.Hum Gene Ther，2013，24（4）：443-456.

［4］ Wu Y，Zhang J，Dong L，et al.Hepatic stimulator substance mitigates hepatic cell injury through suppression of the mitochondrial permeability transition［J］.FEBS J，2010，277（5）：1297-1309.

［5］ 馮如剪，馬蕊香，張曉博，等.飲食、運(yùn)動(dòng)及聯(lián)合早期干預(yù)對(duì)青年非酒精性脂肪肝的臨床療效觀察［J］.河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，34（11）：1432-1435.

［6］ 任夢(mèng)，肖衛(wèi)純，安威.肝刺激因子在 MCD飲食喂養(yǎng)小鼠非酒精性脂肪性肝炎中的作用［J］.中國(guó)組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志，2014，23（5）：387-393.

［7］ Mehlem A，Hagberg CE，Muhl L，et al.Imaging of neutral lipids by oil red O for analyzing the metabolic status in health and disease［J］.Nat Protoc，2013，8（6）：1149-1154.

［8］ Day CP，James OF.Steatohepatitis：a tale of two"hits"？［J］.Gastroenterology，1998，114（4）：842-845.

［9］ Zhang M，Song G，Minuk GY.Effects of hepatic stimulator substance，herbal medicine，selenium／vitamin E，and ciprofloxacin on cirrhosis in the rat［J］.Gastroenterology，1996，110（4）：1150-1155.

［10］ Gribilas G，Zarros A，Zira A，et al.Involvement of hepatic stimulator substance in experimentally induced fibrosis and cirrhosis in the rat［J］.Dig Dis Sci，2009，54（11）：2367-2376.

［11］ 張子玉，羅文明.超聲檢出脂肪肝與血脂水平及肝功能關(guān)系分析［J］.臨床薈萃，2012，27（23）：2050-2052.