戴小宇，朱 海，張曉冬，張曉芳，宗 英，戴益民，張淑英，袁伯俊，陸國才（第二軍醫(yī)大學(xué)藥物安全性評(píng)價(jià)中心，上海200433）

纖維蛋白封閉劑對(duì)SD大鼠連續(xù)腹腔注射給藥14天的毒性研究

戴小宇，朱 海，張曉冬，張曉芳，宗 英，戴益民，張淑英，袁伯俊，陸國才（第二軍醫(yī)大學(xué)藥物安全性評(píng)價(jià)中心，上海200433）

目的評(píng)價(jià)SD大鼠連續(xù)腹腔注射纖維蛋白封閉劑的安全性。方法SD大鼠雌雄分別按體質(zhì)量隨機(jī)分4組，即空白對(duì)照組、纖維蛋白封閉劑低劑量組、中劑量組和高劑量組，每組20只，雌雄各半。3個(gè)給藥組的給藥劑量分別為85.5、171.0和342.0mg／kg，每天腹腔注射給藥，連續(xù)14 d，恢復(fù)期28 d，進(jìn)行一般癥狀、血液學(xué)、血液生化和病理組織學(xué)等指標(biāo)檢測(cè)。結(jié)果與空白對(duì)照組相比，纖維蛋白封閉劑中、高劑量組大鼠第14天的白細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著升高，纖維蛋白原顯著降低，中、高劑量組大鼠脾臟的臟器重量有增加趨勢(shì)。組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)部分高劑量動(dòng)物腹腔出現(xiàn)殘留藥物引起的纖維肉芽組織包裹。上述變化指標(biāo)在恢復(fù)期結(jié)束時(shí)基本可恢復(fù)。結(jié)論大鼠腹腔注射纖維蛋白封閉劑85.5～342.0 mg／kg，安全劑量為85.5 mg／kg，毒性劑量為171.0mg／kg。毒性靶系統(tǒng)或靶部位為血液系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和給藥局部，毒性作用可逆。

纖維蛋白封閉劑；SD大鼠；重復(fù)給藥毒性；臨床前安全性

纖維蛋白封閉劑（fibrin sealant，F(xiàn)S）是一種新型的生物可降解的組織粘合劑和止血藥［1］，主要成分為纖維蛋白原和凝血酶，各組分混合后噴灑于創(chuàng)面形成纖維蛋白，促進(jìn)血凝塊形成從而發(fā)揮止血作用，可用于外科手術(shù)后的止血和促進(jìn)傷口愈合［2，3］，本研究通過腹腔注射重復(fù)給予SD大鼠豬源性FS，觀察FS對(duì)SD大鼠產(chǎn)生的毒性反應(yīng)及嚴(yán)重程度、主要毒性靶器官及毒性損害的可逆程度，找到重復(fù)給藥毒性的安全劑量，為臨床研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法［4-6］

1.1材料

1.1.1 藥物與試劑 纖維蛋白封閉劑（組分Ⅰ：纖維蛋白原，批號(hào)：20071101，規(guī)格：134.54 mg／瓶；組分Ⅰ溶解液，批號(hào)：20071101，規(guī)格：6 m l／瓶。組分Ⅱ：凝血酶，批號(hào)：20071101規(guī)格：893 IU／瓶；組分Ⅱ溶解液，批號(hào)：20071101，規(guī)格：6 m l／瓶）由上海利康生物工程有限公司提供，樣品2～8℃避光保存。血液學(xué)檢測(cè)試劑由西門子醫(yī)學(xué)診斷產(chǎn)品（上海）有限公司生產(chǎn)，血清生化檢測(cè)試劑購自復(fù)星長征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司。

1.1.2 主要儀器 拜耳ADVIA2120血球分析儀（德國）、日立7080全自動(dòng)生化分析儀（日本）、C2000-4型血凝分析儀（日本）、EasyLyte型鈉鉀氯電解質(zhì)分析儀（美國）、OLYMPUS BX41型光學(xué)顯微鏡（日本）和OLYMPUS DP12數(shù)碼相機(jī)（日本）等。

1.1.3 動(dòng)物 SPF級(jí)SD大鼠80只，6～8周齡，雌雄各半，購于上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2003-0002。

1.2方法

1.2.1 劑量設(shè)計(jì) 根據(jù)大鼠藥效學(xué)最低有效劑量33.6 mg／kg，以及大鼠重復(fù)給藥毒性前期試驗(yàn)結(jié)果提示大鼠可以耐受342 mg／kg劑量，且此劑量時(shí)的給藥濃度已達(dá)最適可配濃度，設(shè)低、中、高給藥劑量分別為85.5、171.0、342.0 mg／kg。

1.2.2 動(dòng)物分組及給藥 動(dòng)物分籠飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房，5只／籠，自由攝食與飲水。動(dòng)物房室溫20～26℃，相對(duì)濕度40%～70%，光照周期12 h。經(jīng)檢疫馴化7 d后，大鼠雌雄分別按體重隨機(jī)分成空白對(duì)照組、纖維蛋白封閉劑低劑量組、中劑量組和高劑量組，每組20只，雌雄各半。低、中、高劑量給藥組的給藥劑量分別為85.5、171.0和342.0 mg／kg，給藥體積均為15 m l／kg，相應(yīng)的給藥濃度分別為5.7、11.4和22.8 mg／m l?？瞻讓?duì)照組腹腔注射15 m l／kg生理鹽水。連續(xù)給藥14 d，恢復(fù)期28 d。

1.2.3 觀察指標(biāo) 每天觀察和記錄動(dòng)物的活動(dòng)及精神狀況，皮毛和糞便的顏色及是否成形等。體質(zhì)量每周稱一次，根據(jù)體質(zhì)量增長更新給藥量，計(jì)算出每組動(dòng)物的平均體質(zhì)量，觀察體質(zhì)量增長的動(dòng)態(tài)變化。食量每天稱一次，算出每周每組動(dòng)物的平均食量，觀察其動(dòng)態(tài)變化。分別在給藥結(jié)束（第14天）和恢復(fù)期結(jié)束（第42天），各組均取10只大鼠（雌雄各半）靜脈注射2%戊巴比妥鈉麻醉，經(jīng)腹主動(dòng)脈采血，進(jìn)行血液生化指標(biāo)和血液學(xué)指標(biāo)檢測(cè)。血液學(xué)指標(biāo)包括紅細(xì)胞（RBC）計(jì)數(shù)、血紅蛋白（HGB）定量、血細(xì)胞比容（HCT）、紅細(xì)胞平均容積（MCV）、紅細(xì)胞平均血紅蛋白容量（MCH）、紅細(xì)胞平均血紅蛋白濃度（MCHC）、血小板計(jì)數(shù)（PLAT）、白細(xì)胞（WBC）計(jì)數(shù)和白細(xì)胞分類［中性粒細(xì)胞比例（NEUT%）、淋巴細(xì)胞比例（LYMPH%）、單核細(xì)胞比例（MONO%）、嗜酸性粒細(xì)胞比例（EOS%）和嗜堿性粒細(xì)胞比例（BOS%）］、網(wǎng)織紅細(xì)胞（RET）計(jì)數(shù)、凝血酶原時(shí)間（PT）、活化部分凝血活酶時(shí)間（APTT）、凝血酶時(shí)間（TT）和血漿纖維蛋白原（FIB）。血液生化指標(biāo)包括血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）、乳酸脫氫酶（LDH）、總膽紅素（TBI）、尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）、總蛋白（TP）、白蛋白（A lb）、血糖（Glu）、總膽固醇（Tch）、三酰甘油（TG）、肌酸磷酸激酶（CPK）、血清鈣（Ca）和血清磷（P）、血清鉀（K）、血清鈉（Na）和血清氯（Cl）。第14天及第42天各組麻醉大鼠完全放血安樂死后進(jìn)行剖檢，按《化學(xué)藥長期毒性試驗(yàn)指導(dǎo)原則》要求摘取臟器，固定后進(jìn)行組織切片，HE染色后進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。股骨骨髓涂片后進(jìn)行骨髓細(xì)胞學(xué)檢查，對(duì)心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟、腦、腎上腺、胸腺、睪丸、附睪、子宮、卵巢質(zhì)量進(jìn)行測(cè)量并計(jì)算相對(duì)質(zhì)量。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理 對(duì)于體質(zhì)量、攝食量、血液學(xué)指標(biāo)及血清生化檢查指標(biāo)等計(jì)量資料，均按照以下方法統(tǒng)計(jì)：①首先進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)；②如果資料符合正態(tài)性（檢驗(yàn)P＞0.05），則進(jìn)行方差齊性分析，如果數(shù)據(jù)方差齊性，則進(jìn)行方差分析檢驗(yàn)（F檢驗(yàn)）。如果方差分析檢驗(yàn)結(jié)果顯著（P≤0.05），則進(jìn)一步用LSD-t、Dunett-t參數(shù)檢驗(yàn)法進(jìn)行多重比較檢驗(yàn)；如果方差分析結(jié)果不顯著（P＞0.05），則統(tǒng)計(jì)結(jié)束。③如果數(shù)據(jù)方差不齊性，則進(jìn)行Dunett-T3參數(shù)檢驗(yàn)法進(jìn)行多重比較檢驗(yàn)。④如果資料不符合正態(tài)性，則進(jìn)行K ruskal-Wallis檢驗(yàn)（H檢驗(yàn)）和Median檢驗(yàn)。如果K ruskal-Wallis檢驗(yàn)結(jié)果顯著（P≤0.05），則進(jìn)一步用非參數(shù)檢驗(yàn)法進(jìn)行兩兩比較檢驗(yàn)；如果K ruskal-Wallis檢驗(yàn)結(jié)果不顯著，則統(tǒng)計(jì)結(jié)束。對(duì)于臟器病理變化比例等計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1一般狀況 試驗(yàn)期間，各劑量組大鼠一般行為、活動(dòng)、毛發(fā)、大小便與對(duì)照組相比未見明顯異常。

2.2體重、攝食量 與空白對(duì)照組相比，相同時(shí)間點(diǎn)給藥組大鼠的體質(zhì)量和攝食量未見與藥物相關(guān)的明顯變化。

2.3血液學(xué)指標(biāo) 與空白對(duì)照組相比，中、高劑量給藥組大鼠第14天的WBC顯著升高，F(xiàn)IB顯著降低。上述指標(biāo)顯現(xiàn)一定的劑量依賴性。其余部分指標(biāo)雖有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但均在正常范圍內(nèi)波動(dòng)。結(jié)果見表1。

表1 纖維蛋白封閉劑腹腔注射對(duì)大鼠血液學(xué)指標(biāo)的影響（n＝10，ˉx±s）

2.4血清生化指標(biāo) 與空白對(duì)照組相比，各給藥組大鼠第14天及第42天檢測(cè)的生化指標(biāo)無明顯差異，表明受試物對(duì)ALT、AST、ALP、TBI、BUN、Cr、TP、A lb、Glu、Tch、LDH、CPK、TG、K、Na和Cl無明顯影響。

2.5骨髓細(xì)胞檢查 骨髓涂片結(jié)果顯示，粒細(xì)胞系統(tǒng)、紅細(xì)胞系統(tǒng)、巨核細(xì)胞系統(tǒng)、淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞系統(tǒng)均未見異常增生。

2.6對(duì)臟器重量的影響 臟器稱重結(jié)果顯示，第14天時(shí)大鼠脾臟重量有劑量依賴性升高趨勢(shì)，第42天時(shí)基本能恢復(fù)。其余臟器未見明顯影響。

表2 纖維蛋白封閉劑腹腔注射對(duì)大鼠脾臟絕對(duì)質(zhì)量的影響（n＝10，ˉx±s，g）

2.7病理學(xué)檢查 病理組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)給藥結(jié)束時(shí)中、高劑量組大鼠脾臟淋巴細(xì)胞增生；部分高劑量組動(dòng)物的腹腔臟層腹膜組織，肉眼或鏡下查見有注入的藥劑殘留誘發(fā)的瘤樣隆起病灶，最大的直徑達(dá)1.2 cm，單發(fā)或多灶散在，灰白色。鏡下觀察病灶外裹厚層的增生纖維結(jié)締組織，中心可見粉染的大量無定形膠樣固態(tài)物（殘留藥物）。個(gè)別高劑量組大鼠病灶內(nèi)還混有中性粒細(xì)胞（圖1～3）?；謴?fù)期結(jié)束時(shí)各組大鼠未見藥物相關(guān)的器質(zhì)性病變。

3 討論

局部止血藥已在國外被廣泛使用，但有臨床報(bào)道手術(shù)中局部止血藥殘留會(huì)增加術(shù)后不良反應(yīng)的發(fā)生，同時(shí)增加了術(shù)后CT、MRI 等影像學(xué)對(duì)于術(shù)后恢復(fù)診斷的難度，甚至?xí)褮埩舻闹寡幷`診為腫瘤或膿腫［7-9］。因此手術(shù)過程中應(yīng)盡可能避免使用過多的局部止血藥。

圖1 空白對(duì)照組SD大鼠第14天腸系膜組織結(jié)構(gòu)（HE，×100）

圖2 高劑量組SD大鼠第14天腸系膜組織結(jié)構(gòu)（HE，×100）

本研究中的受試物纖維蛋白封閉劑是豬源的蛋白分子復(fù)合制劑，主要由凝血酶與纖維蛋白組成。凝血酶與纖維蛋白獨(dú)立分裝于Y型針管中的2個(gè)臂中，給藥時(shí)，二組份于Y型針管的共同管道內(nèi)混合并發(fā)生酶催化反應(yīng)，到達(dá)給藥部位表面時(shí)可快速凝固，并達(dá)到止血的目的。隨著此類藥物的臨床應(yīng)用越來越普遍，其安全性也越來越受到人們的關(guān)注［10］。

圖3 高劑量組SD大鼠第14天臟層腹膜組織結(jié)構(gòu)（HE，×100）

本研究血液學(xué)指標(biāo)發(fā)現(xiàn)高劑量組大鼠的WBC與空白對(duì)照組相比顯著升高，可能與未完全吸收的藥劑殘留物在腹腔內(nèi)引起炎癥反應(yīng)，形成纖維肉芽組織，并對(duì)大鼠腹腔局部具有一定刺激作用有關(guān)。表明給藥劑量較高時(shí)，藥物對(duì)給藥部位存在一定的刺激性。

中、高劑量組大鼠纖維蛋白在第14天與對(duì)照組相比顯著降低，脾臟絕對(duì)質(zhì)量和相對(duì)質(zhì)量有增加趨勢(shì)，病理組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)中、高劑量組大鼠脾臟淋巴細(xì)胞增生，提示纖維蛋白封閉劑可能對(duì)動(dòng)物的免疫系統(tǒng)有一定影響。

第14天變化的指標(biāo)在恢復(fù)期結(jié)束時(shí)基本恢復(fù)，并且病理組織學(xué)觀察中脾臟未見明顯異常，表明藥物的毒性作用較輕且可逆。

因此，纖維蛋白封閉劑85.5～342.0 mg／kg連續(xù)腹腔注射大鼠14 d，安全劑量為85.5 mg／kg， 171.0 mg／kg劑量以上時(shí)可致血液系統(tǒng)的WBC增加、纖維蛋白減少、脾臟質(zhì)量增加，藥物也不能完全被吸收，藥劑殘留物在腹腔內(nèi)可能會(huì)導(dǎo)致纖維肉芽組織形成，但上述毒性作用均可逆。臨床使用時(shí)應(yīng)注意藥物較高劑量使用時(shí)對(duì)毒性靶部位血液系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和給藥局部可能存在的影響，避免發(fā)生術(shù)后不良反應(yīng)。

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Repeat-dose toxicity study of fibrin sealant in SD rats

DAIXiaoyu，ZHU Hai，ZHANG Xiaodong，ZHANG Xiaofang，ZONG Ying，DAIYimin，ZHANG Shuying，YUAN Bojun，LU Guocai（Center for New Drug Evaluation，Second M ilitary Medical University，Shanghai200433，China）

ObjectiveTo evaluate the safety of fibrin sealant（FS）intraperitoneal injection in SD rats.Methods80male and female SD rats were random ly divided into four groups（0，85.5，171.0，342.0mg／kg）by body weight.A ll ratswere intraperitoneally injected w ith vehicle or FS daily for 14 days followed by a 28-day recovery period.The clinical signs，hematological and biochem ical indices weremeasured.The pathology were observed.ResultsIncrease of white blood cell count（WBC）and decrease of fibrinogen（FIB）in d 14 were found in 171.0mg／kg and 342.0mg／kg dosage groups.Furthermore，the tendency of weight increase of spleen were found in 171.0mg／kg and 342.0mg／kg dosage groups.Pathologicalexams of peritoneal cavity found that there were granulation tissues containing FS in some of the rats in 342.0 mg／kg group.A ll of these changes got reversed after the recovery period.ConclusionThe safety dose in this study is considered to be 85.5mg／kg，and the toxicity dose is 171.0mg／kg.The target toxicity systems or siteof FS in SD rats are hematological system，immune system and injection site.The toxic effects of FS are reversible.

fibrin sealant；SD rats；repeat-dose toxicity；preclinical safety

R965

］ A

1006-0111（2015）03-0231-04

10.3969／j.issn.1006-0111.2015.03.010

2014-08-27

2014-12-30

［本文編輯］ 陳 靜

“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)（2014ZX09J14106）；上海市公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室建設(shè)計(jì)劃（12GWZX0501）；上海市自然科學(xué)基金（13ZR1449400）

戴小宇，碩士研究生.研究方向：新藥臨床前安全性評(píng)價(jià).Tel：（021）81871035；E-mail：littlefishdai＠163.com

陸國才，博士生導(dǎo)師，教授.研究方向：新藥臨床前安全性評(píng)價(jià).Tel：（021）81871032；E-mail：new drug＠smmu.edu.cn