檀巧婷，嚴(yán) 佳，鐘桂香，宋洪濤（南京軍區(qū)福州總醫(yī)院藥學(xué)科，福建福州350025）

硝酸甘油軟膏的無(wú)菌檢查方法學(xué)驗(yàn)證

檀巧婷，嚴(yán) 佳，鐘桂香，宋洪濤（南京軍區(qū)福州總醫(yī)院藥學(xué)科，福建福州350025）

目的建立硝酸甘油軟膏的無(wú)菌檢查方法，并對(duì)方法進(jìn)行驗(yàn)證。方法取預(yù)熱至45℃的供試品10支（15 g／支），每支稱(chēng)取1 g，加至含溶化的司盤(pán)80、聚山梨酯80無(wú)菌混合物和無(wú)菌玻璃珠的錐形瓶中，振搖混勻后，加入45℃的pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨水緩沖液至100 m l，使供試品充分乳化。按薄膜過(guò)濾法，細(xì)菌、真菌每膜用300 m l pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗，消除抑菌活性。結(jié)果經(jīng)方法驗(yàn)證，硝酸甘油軟膏供試品組、陰性對(duì)照組均無(wú)菌生長(zhǎng)，試驗(yàn)組各濾器中試驗(yàn)菌與相應(yīng)對(duì)照組比較均生長(zhǎng)良好，說(shuō)明供試品在該檢驗(yàn)量和檢驗(yàn)條件下無(wú)抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不計(jì)。結(jié)論薄膜過(guò)濾法有效可行，可用于硝酸甘油軟膏的無(wú)菌檢查。

硝酸甘油軟膏；無(wú)菌檢查；方法學(xué)驗(yàn)證

硝酸甘油軟膏主要成分為硝酸甘油，能直接松弛平滑肌，對(duì)膽堿能及腎上腺素能神經(jīng)支配的平滑肌均有作用，以松弛血管平滑肌作用最強(qiáng)，尤其是小血管平滑肌。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［1-4］，硝酸甘油軟膏對(duì)于治療肛裂、痔瘡等具有較好的療效。我科自制的硝酸甘油軟膏，主要用于治療肛裂及緩解與肛裂有關(guān)的癥狀，也可用于痔瘡治療，是一種血管擴(kuò)張類(lèi)藥物，按照《中國(guó)藥典》2010年版附錄規(guī)定，用于燒傷或嚴(yán)重創(chuàng)傷的軟膏劑應(yīng)進(jìn)行無(wú)菌檢查，并對(duì)方法進(jìn)行驗(yàn)證，以保證該方法的可靠性。因此，筆者按規(guī)定對(duì)硝酸甘油軟膏無(wú)菌檢查方法進(jìn)行研究，并進(jìn)行驗(yàn)證。

1 儀器與材料

1.1儀器 GHP-9160型隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司）、DHG-9145A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科技有限公司）、SW-CJ-1B型凈化工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備廠）、M JPS-150型霉菌培養(yǎng)箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）、WJ-6無(wú)菌檢測(cè)儀（天津市羅根科技有限公司）、LDZX-40KBS型立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）。

1.2試驗(yàn)菌種 試驗(yàn)用菌分別是：金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）［CMCC（B）26003］（第3代）；生孢梭菌（Clostridium sporogenes）［CMCC（B）64941］（第4代）；枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）［CMCC（B）63501］（第3代）；白念珠菌（Candida albicans）［CMCC（F）98001］（第4代）；黑曲霉（Aspergillusniger）［CMCC（F）98003］（第3代）；銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）［CMCC（F）10104］（第3代），均由福建省食品藥品檢驗(yàn)所提供。

1.3培養(yǎng)基及稀釋液 本次試驗(yàn)所用到的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（批號(hào)120417）、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)121224）、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)130221）、改良馬丁培養(yǎng)基（批號(hào)1211282）、膽鹽乳糖培養(yǎng)基（批號(hào)1204192）、甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)111201）、溴化十六烷基三甲胺瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)131124）和pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（批號(hào)1212132）均由北京三藥科技開(kāi)發(fā)公司提供。

1.4樣品 硝酸甘油軟膏（規(guī)格15 g：30 mg），由南京軍區(qū)福州總醫(yī)院藥學(xué)科制劑室提供。

2 方法與結(jié)果

2.1菌液制備

2.1.1 接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，接種生孢梭菌的新鮮培養(yǎng)物至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，經(jīng)30～35℃培養(yǎng)18～24 h后，分別取上述培養(yǎng)物1 m l＋9 m l 0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液，10倍稀釋至10－6～10－7，細(xì)菌數(shù)為50～100 CFU／m l，做活菌計(jì)數(shù)備用。

2.1.2 接種白念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中，經(jīng)23～28℃培養(yǎng)24～48 h后，取白念珠菌液體培養(yǎng)物1 m l＋9 m l 0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液，10倍稀釋至10－4～10－7，細(xì)菌數(shù)為50～100 CFU／m l，做活菌計(jì)數(shù)備用。

2.1.3 接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基中，經(jīng)23～28℃培養(yǎng)5～7 d后，取黑曲霉斜面培養(yǎng)物，加3～5 m l 0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液將孢子洗脫，吸出孢子懸液1 m l＋9 m l 0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液，10倍稀釋至10－4～10－7，細(xì)菌數(shù)為50～100 CFU／m l，做活菌計(jì)數(shù)備用。

2.2供試液制備 取預(yù)熱至45℃的供試品10支，每支稱(chēng)取1 g，加至含溶化的（溫度不超過(guò)45℃）5 g司盤(pán)80、10 g聚山梨酯80無(wú)菌混合物和無(wú)菌玻璃珠的錐形瓶中，劇烈振搖，混勻后，慢慢加入45℃的pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨水緩沖液至100 m l，邊加邊振搖，使供試品充分乳化。

2.3供試液取樣量 每株驗(yàn)證菌檢驗(yàn)量為10支。

2.4方法驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)（薄膜過(guò)濾法） 金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌、白念珠菌、黑曲霉菌：取制備好的供試液注入濾筒中，按薄膜過(guò)濾法過(guò)濾，用pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液約300m l沖洗，每次100m l，分次振搖沖洗，在最后一次沖洗液中加入小于100 CFU的試驗(yàn)菌，過(guò)濾，將培養(yǎng)基100 m l加至濾筒中；另一個(gè)濾筒加入同體積培養(yǎng)基及等量的試驗(yàn)菌，作為陽(yáng)性對(duì)照，并做陰性對(duì)照，按規(guī)定溫度培養(yǎng)3～5 d，逐日觀察。各試驗(yàn)菌同法操作。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 無(wú)菌檢查驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

3.1在檢驗(yàn)量為10支，每支取1 g，每片膜沖洗量為100m l×3次的條件下，樣品對(duì)金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌、白念珠菌、黑曲霉無(wú)抑菌作用。

3.2硝酸甘油軟膏在含供試品各管中的試驗(yàn)菌均生長(zhǎng)良好，并且與陽(yáng)性對(duì)照試管內(nèi)的培養(yǎng)結(jié)果相似，則供試品的檢驗(yàn)量在該條件下無(wú)抑菌活性或抑菌活性消除，可采用薄膜過(guò)濾法進(jìn)行無(wú)菌檢查。

3.3硝酸甘油軟膏為淡黃色半固體狀外用制劑，是以凡士林為油脂性基質(zhì)，因此本文采用稀釋劑稀釋、保溫至45℃振搖混勻，并加入司盤(pán)80、聚山梨酯80，增加供試品分散性，使供試品充分乳化均勻，避免油性基質(zhì)等細(xì)小顆粒在薄膜過(guò)濾過(guò)程中堵塞濾膜［5］。

［1］ 山院飛，馮六泉，張曉元，等.硝酸甘油軟膏聯(lián)合創(chuàng)灼膏治療肛裂療效觀察［J］.人民軍醫(yī)，2011，54（3）：209-210.

［2］ 徐 毅.硝酸甘油軟膏加擴(kuò)肛與單純擴(kuò)肛治療96例對(duì)照觀察［J］.結(jié)直腸肛門(mén)外科，2012，18（3）：182-183.

［3］ 張 倩，林銀花，王 娟，等.硝酸甘油軟膏的制備與質(zhì)量控制［J］.醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2010，29（6）：768-770.

［4］ 孔 嬋.復(fù)方硝酸甘油軟膏和九華膏治療早期肛裂的療效對(duì)比［J］.西部醫(yī)學(xué)，2009，21（9）：1540-1541.

［5］ 吳 鑫，陳 希，鄢雷娜.鹽酸特比萘芬乳膏微生物限度檢查法的方法學(xué)研究［J］.中國(guó)藥事，2013，27（1）：48-64.

Validation for sterility testmethod of nitroglycerin ointment

TAN Qiaoting，YAN Jia，ZHONG Guixiang，SONG Hongtao（Department of Pharmacy，F(xiàn)uzhou General Hospital of Nanjing M illitary Region，F(xiàn)uzhou 350025，China）

ObjectiveTo establish and validate a method of sterility test for nitroglycerin ointment and validate this method.MethodsTen nitroglycerin ointments of 1 g were preheated oven to 45℃for sample，and added to conical flask which containingmelted span 80，polysorbate80 sterilemixture and sterile glass beads，and were shakeaftermixing，the sample fully emulsified by adding to 100 m l 45℃pH 7.0 sterile sodium chloride-peptone water buffer.According to themethod ofmembrane filtration，bacteria and fungus in eachmembranew ith 300m l pH 7.0 sterile sodium chloride-peptonewater buffer flush，the bacteriostatic activity was elim inated.ResultsBy the method validation，nitroglycerin ointment sample group，negative control group were sterile grow th，and test group in each filter of the test bacteria compared w ith control groupswere grow ing well，so the samples had no inhibitory effector the antimicrobialeffectwould not take into account.ConclusionMembrane filtration was reliable，which could be used for sterility test for nitroglycerin ointment.

nitroglycerin ointment；sterility test；validation of themethod

R943

］ A

1006-0111（2015）03-0253-02

10.3969／j.issn.1006－0111.2015.03.016

2014-04-23

2014-09-24

［本文編輯］ 顧文華

檀巧婷，藥師.研究方向：藥物分析.Tel：（0591）22859963；E-mail：tqt-010＠163.com

宋洪濤，博士，主任藥師，博士生導(dǎo)師.Tel：（0591）22859459；E-mail：sohoto＠vip.163.com