寇曉霞，丁永梅，黃 耀，袁振剛，錢其軍（東方肝膽外科醫(yī)院生物治療科，上海200438）

?生物治療?

吉西他濱對(duì)胰腺癌外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞影響的研究

寇曉霞，丁永梅，黃 耀，袁振剛，錢其軍（東方肝膽外科醫(yī)院生物治療科，上海200438）

目的探討吉西他濱對(duì)胰腺癌外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的影響，為進(jìn)一步提高過(guò)繼免疫治療的療效提供依據(jù)和參考。方法本研究入選2012年1月至2014年10月收治的32例胰腺癌患者，分為吉西他濱組（吉西他濱＋過(guò)繼免疫治療）和對(duì)照組（單純過(guò)繼免疫治療），觀察兩組患者治療前后外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞水平、化療不良反應(yīng)，并對(duì)兩組患者的生存時(shí)間進(jìn)行分析比較。結(jié)果吉西他濱組患者治療后外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞水平較治療前顯著降低，與對(duì)照組相比亦顯著降低，兩組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），吉西他濱組中位生存時(shí)間較對(duì)照組延長(zhǎng)1.3個(gè)月（10.0個(gè)月與8.7個(gè)月比較）。結(jié)論吉西他濱化療可以顯著降低胰腺癌患者外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞水平，有效調(diào)節(jié)患者的腫瘤免疫耐受，提高過(guò)繼免疫治療的療效。

吉西他濱；胰腺癌；調(diào)節(jié)性T細(xì)胞；過(guò)繼免疫治療

胰腺癌是一種發(fā)病隱匿、進(jìn)展快、預(yù)后差、惡性程度極高的消化系統(tǒng)腫瘤，其發(fā)病率呈逐年升高的趨勢(shì)。手術(shù)切除仍是目前唯一的根治手段，但是超過(guò)80%的患者確診時(shí)已屬晚期，難以進(jìn)行手術(shù)切除，即使接受手術(shù)的患者，其中位生存期也僅有15～19個(gè)月［1］。對(duì)于手術(shù)無(wú)法切除的局部晚期或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者，其中位生存期僅6個(gè)月左右［2］。以化療為主的綜合治療目前仍是晚期胰腺癌的主要治療手段，而吉西他濱則是晚期胰腺癌的標(biāo)準(zhǔn)一線化療藥物［3］。隨著分子生物學(xué)和免疫學(xué)的快速發(fā)展，腫瘤微環(huán)境成為目前研究的熱點(diǎn)，其中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cells，Tregs）是腫瘤微環(huán)境中一種重要的免疫抑制性細(xì)胞，通過(guò)直接和間接作用調(diào)控機(jī)體的抗腫瘤免疫功能。胰腺癌患者外周血和腫瘤微環(huán)境中的Tregs明顯增多，并且隨著腫瘤的進(jìn)展，Tregs數(shù)量逐漸增多［4，5］，那么，清除或干預(yù)Tregs對(duì)免疫功能的抑制在胰腺癌的治療中就顯得至關(guān)重要。本課題主要研究吉西他濱對(duì)胰腺癌患者外周血中Tregs的影響，進(jìn)一步評(píng)價(jià)其對(duì)免疫功能的影響。

1 材料和方法

1.1研究對(duì)象及一般資料 選自2012年1月至2014年10月東方肝膽外科醫(yī)院生物治療科收治的32例胰腺癌患者，21例經(jīng)病理證實(shí)，11例經(jīng)臨床資料及影像學(xué)明確診斷。分為2組，一組為吉西他濱組（n＝16），行吉西他濱化療聯(lián)合過(guò)繼免疫治療，另一組為對(duì)照組（n＝16），單純行過(guò)繼免疫治療。兩組患者的一般資料見表1。

1.2化療方案 采用吉西他濱單藥方案：鹽酸吉西他濱（批號(hào)：C273987A，法國(guó)禮來(lái)有限公司）1 000 mg／m2靜脈滴注30 m in，每周1次，3周為一療程。在治療過(guò)程中給予預(yù)防性止吐、補(bǔ)液及對(duì)癥支持治療。

表1 兩組患者一般資料比較（n＝16，例）

1.3過(guò)繼免疫治療方案 ①外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）的采集：在治療周期的當(dāng)天用FRESENIUS COM.TEC血細(xì)胞分離機(jī)（FRESENIUS KABI公司）進(jìn)行外周血單個(gè)核細(xì)胞采集，采用auto MNC程序，P1YA耗材，采集數(shù)量約為2×108／L。②樹突狀細(xì)胞-細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞（dendritic cells＆cytokineinduced killer cells，DC-CIK）的分離及培養(yǎng)：采集出的PBMC用不含血清的AIM-V培養(yǎng)液（Gibco，Invitrogen）洗滌2次后，稀釋濃度至4×106／L。將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)袋中培養(yǎng)2 h，收集非貼壁細(xì)胞，用于培養(yǎng)CIK細(xì)胞，貼壁細(xì)胞用于制備DC細(xì)胞，向其中加入含有GM-CSF（1 000 ng／m l）、IL-4（1 000 U／m l）、和FLT-3（50 ng／m l）的培養(yǎng)液，每2 d更換1／2培養(yǎng)液，補(bǔ)充細(xì)胞因子，第6天用包含多種腫瘤抗原（TAA）的腺病毒（血清35型）進(jìn)行轉(zhuǎn)染，收集DC細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后，向其中加入TNF-α（100 ng／m l）和CD40L（50 ng／m l），然后繼續(xù)培養(yǎng)2 d。非貼壁細(xì)胞收集后將濃度調(diào)整至2×109／m l，然后放入37℃、5%CO2孵箱中，加入IFN-γ（1 000 U／m l）培養(yǎng)，每天更換1／2培養(yǎng)液，加入CD3多克隆抗體（m Ab）（50 ng／m l）和IL-2（1 000 U／m l）。第9天將經(jīng)過(guò)多抗原刺激的DC加入CIK培養(yǎng)液中，在上述條件下共同培養(yǎng)2 d。經(jīng)細(xì)菌、真菌及內(nèi)毒素檢測(cè)陰性后分別于第11、15天收集懸浮的、經(jīng)表型鑒定的成熟DC，溶于1 m l生理鹽水中，皮內(nèi)注射于腹股溝淋巴結(jié)；分別于第11、13、15天收集CIK細(xì)胞，細(xì)胞總數(shù)＞2×1010／L，離心、洗滌后，溶于含0.25%人血白蛋白的300 m l生理鹽水溶液中，靜脈滴注，30 m in回輸入患者體內(nèi)?；熂吧锩庖咧委熃Y(jié)合的方法見圖1。

圖1 化療與DC-CIK治療結(jié)合的方法

1.4觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法 化療前3 d及化療結(jié)束后3 d檢測(cè)研究對(duì)象外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞CD4＋CD25＋FoxP3＋（Tregs），Tregs的檢測(cè)方法：清晨空腹抽取EDTA抗凝靜脈血3 m l，用流式細(xì)胞儀（Beckman Coulter公司，CytomicsTMFC500）檢測(cè)外周血單個(gè)核細(xì)胞膜表面CD4＋CD25＋FoxP3＋細(xì)胞，記錄數(shù)據(jù)，采用CXP軟件分析數(shù)據(jù)。同時(shí)觀察吉西他濱組患者化療后不良反應(yīng)，并于每月對(duì)全部研究對(duì)象進(jìn)行隨訪（隨訪時(shí)間至2014年12月），比較兩組生存時(shí)間差異。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，兩組治療前后及組間比較采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的兩因素兩水平方差分析，以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，生存分析采用Kaplan-Meier分析，繪制生存曲線，計(jì)算中位生存時(shí)間，兩組生存率的比較采用Log-Rank檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞變化 見表2。

2.2中位生存時(shí)間 對(duì)全部研究對(duì)象進(jìn)行隨訪，繪制生存曲線，并比較中位生存時(shí)間，見圖2及表3。

2.3吉西他濱化療后的不良反應(yīng) 見表4。

表2 兩組治療前后Tregs變化的比較（ˉx±s，n＝16）

圖2 兩組患者生存曲線

表3 兩組中位生存時(shí)間比較（月）

表4 吉西他濱化療中相關(guān)的不良反應(yīng)［例（%）］

3 討論

胰腺癌目前仍是腫瘤治療的難點(diǎn)之一，其死亡率在惡性腫瘤中居第4位［6］。文獻(xiàn)報(bào)道在胰腺癌患者外周血中檢測(cè)出多種免疫抑制性細(xì)胞，使得其侵襲性增強(qiáng)［7］，其中包括Tregs，通過(guò)抑制抗腫瘤效應(yīng)細(xì)胞應(yīng)答來(lái)發(fā)揮作用［8］。Tregs在腫瘤免疫中起負(fù)調(diào)節(jié)作用，它的增加有利于腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，腫瘤局部Tregs可通過(guò)不同的機(jī)制抑制免疫反應(yīng)，促使腫瘤細(xì)胞免疫耐受、逃逸。TCR信號(hào)所激活的Tregs能夠抑制CD4＋和CD8＋T細(xì)胞的活化、增殖，并且這種抑制作用是非抗原特異性的。除此之外，Tregs還能抑制NK細(xì)胞的增殖、細(xì)胞因子分泌和細(xì)胞毒作用，并對(duì)單核／巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、B細(xì)胞等免疫活性細(xì)胞同樣有抑制作用［9］?；熕幬锟赏ㄟ^(guò)抑制腫瘤微環(huán)境中相關(guān)環(huán)節(jié)，促進(jìn)Tregs凋亡，使Tregs數(shù)目減少［10］。吉西他濱作為一種抗代謝藥物，主要通過(guò)抑制DNA的合成和修復(fù)，起到干預(yù)腫瘤細(xì)胞脫氧核苷酸合成的作用，藥理性質(zhì)獨(dú)特，毒副作用低，目前仍是治療局部晚期或轉(zhuǎn)移性胰腺癌的基石性藥物。吉西他濱對(duì)Tregs的抑制作用國(guó)外已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道，如Homma等［11］報(bào)道了32例胰腺癌患者經(jīng)過(guò)以吉西他濱為主的聯(lián)合化療后外周血Tregs較治療前明顯下降（P＝0.032），但其他淋巴細(xì)胞亞群及NK細(xì)胞數(shù)則無(wú)明顯改變。Bunt等［12］也報(bào)道了吉西他濱可降低胰腺癌患者Tregs及髓系抑制性細(xì)胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSC），改善免疫逃逸及耐受。但國(guó)內(nèi)的相關(guān)報(bào)道目前仍較少。

本研究發(fā)現(xiàn)，兩組治療后Tregs均較治療前下降，但吉西他濱組下降程度更明顯，且較對(duì)照組相比，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），這也說(shuō)明，經(jīng)過(guò)吉西他濱化療后可顯著降低患者體內(nèi)及腫瘤組織內(nèi)聚集的Tregs，可對(duì)過(guò)繼免疫治療起到增效作用，類似結(jié)果Shindo等［6］也曾有報(bào)道。本研究還發(fā)現(xiàn)，吉西他濱通過(guò)降低Tregs水平，調(diào)節(jié)免疫耐受，聯(lián)合免疫治療可明顯延長(zhǎng)晚期胰腺癌患者生存時(shí)間，較單純免疫治療組效果更好，中位生存時(shí)間延長(zhǎng)1.3個(gè)月，雖未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但患者仍可明顯獲益，且未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的原因考慮可能與樣本量較小，隨訪時(shí)間短，刪失數(shù)據(jù)較多有關(guān)，需大樣本隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)來(lái)進(jìn)行遠(yuǎn)期療效的比較。本研究中吉西他濱化療后不良反應(yīng)較小，其中貧血、乏力、食欲減退、白細(xì)胞減少及血小板減少出現(xiàn)的比例稍高，但也均為輕度，無(wú)須特殊處理，耐受性好。由此可見，吉西他濱化療安全可靠。

過(guò)繼免疫治療目前已取得了較滿意的結(jié)果，但在晚期腫瘤患者中，腫瘤負(fù)荷過(guò)大，Tregs聚集過(guò)多，可通過(guò)殺傷作用影響效應(yīng)細(xì)胞的療效，這也是影響過(guò)繼免疫治療效果的重要原因之一。本研究通過(guò)對(duì)比兩組患者治療前后Tregs水平及生存時(shí)間，發(fā)現(xiàn)晚期胰腺癌患者通過(guò)吉西他濱化療后明顯降低外周血中Tregs水平，改善其抗腫瘤免疫抑制，與過(guò)繼免疫治療相結(jié)合，可以進(jìn)一步提高過(guò)繼免疫治療的療效，延長(zhǎng)生存期，為晚期胰腺癌的治療提供可靠、有效的方法。

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Changes of regulatory T cells in peripheral blood after gemcitabine chemotherapy for pancreatic cancer patients

KOU Xiaoxia，DING Yongmei，HUANG Yao，YUAN Zhengang，QIAN Qijun（Department of Biotherapy，Eastern Hepatobiliary Surgical Hospital，Shanghai200438，China）

ObjectiveTo investigate the influence of gemcitabine chemotherapy on levels of regulatory T cells（Tregs）in peripheral blood for patientsw ith pancreatic cancer and provide evidence and reference for improving the efficacy of adoptive immunotherapy.Methods 32 patients were enrolled in this study from January 2012 to October 2014，among whom 16 received gemcitabine chemotherapy combined w ith adoptive immunotherapy（gemcitabine group），the other 16 patients received adoptive immunotherapy only（control group）.The level of Tregs in peripheral blood，side effect and overall survivalwere observed before and after the therapy.ResultsThe number of Tregs in peripheral blood was significantly decreased after gemcitabine chemotherapy，and itwas also lower than that of the control group.The overall survival time of the gemcitabine group was 1.3 mo longer than the control group（10.0 mo vs8.7 mo）.ConclusionTherapeutic regimen of gemcitabine can remarkly deplete Tregs in peripheralblood of patientsw ith pancreatic cancer，effectively regulate tumor immune tolerance，and improve the efficacy of adoptive immunotherapy.

gemcitabine；pancreatic cancer；regulatory T cells（Tregs）；adoptive immunotherapy

R979.1，R935

A

］ 1006-0111（2015）03-0258-04

10.3969／j.issn.1006-0111.2015.03.018

2015-01-11

2015-04-17

［本文編輯］ 顧文華

第二軍醫(yī)大學(xué)青年啟動(dòng)基金課題（2012QN18）

寇曉霞，醫(yī)師，碩士研究生.研究方向：惡性腫瘤的化療及生物治療.

錢其軍，博士，研究員，博士生導(dǎo)師.研究方向：免疫細(xì)胞過(guò)繼治療及腫瘤的基因、病毒治療的研究.E-mail：13311850698＠163.com