黃啟強(qiáng)，黃麗慶，周 青，肖 寒，黃伙榮，胡淑燕(遵義醫(yī)學(xué)院第五附屬(珠海)醫(yī)院，廣東珠海 519100)

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HCV早期感染者病毒載量與CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞相關(guān)性研究*

黃啟強(qiáng)，黃麗慶，周 青，肖 寒，黃伙榮，胡淑燕(遵義醫(yī)學(xué)院第五附屬(珠海)醫(yī)院，廣東珠海 519100)

目的 研究丙型肝炎病毒(HCV)早期感染者(抗原陽(yáng)性、抗體陰性)的HCV病毒載量與CD4+CD25+叉頭/翅膀狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子(Foxp3+)調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞水平的相關(guān)性，分析CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞在HCV感染中的作用。方法 應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(FQ RT-PCR)技術(shù)檢測(cè)22例HCV核心抗原陽(yáng)性、抗體陰性(即HCV Ag陽(yáng)性、抗-HCV陰性)的早期感染病例、26例核心抗原陽(yáng)性、抗體陽(yáng)性(即HCV Ag陽(yáng)性、抗-HCV陽(yáng)性)的慢性HCV感染病例，24例核心抗原陰性、抗體陽(yáng)性(即HCV Ag陰性、抗-HCV陽(yáng)性)的既往HCV感染病例及22例健康對(duì)照組HCV RNA病毒載量；并用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)各組外周血有核細(xì)胞中的CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞水平。結(jié)果 HCV Ag陽(yáng)性、抗-HCV陰性組，HCV Ag陽(yáng)性、抗-HCV陽(yáng)性組，HCV Ag陰性、抗-HCV陽(yáng)性組及健康對(duì)照組CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞逐級(jí)下降，其中抗原陽(yáng)性、抗體陰性組[(4.86±2.14)%]高于其他組[分別為(3.74±1.67)%、(2.74±1.27)%、(2.56±1.18)%]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為2.023、4.125、4.402，P<0.05)；HCV Ag陽(yáng)性、抗-HCV陰性組CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞與HCV RNA病毒載量的對(duì)數(shù)(copy/mL,Ig)呈正相關(guān)(r=0.535,P<0.05)。結(jié)論 HCV早期感染者CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞水平與高病毒調(diào)定點(diǎn)相關(guān)，CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞水平可能是加速HCV早期感染的影響因素之一。

HCV； 早期感染； 調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞； 病毒載量； 相關(guān)性

調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(Treg)對(duì)免疫平衡及維持免疫耐受具有重要意義，主要表現(xiàn)為免疫無(wú)能性和免疫抑制性，可以控制機(jī)體損傷的免疫反應(yīng)[1-2]。丙型肝炎病毒(HCV)感染者機(jī)體免疫功能紊亂，細(xì)胞免疫應(yīng)答在丙型肝炎的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要作用。具有抑制活性的標(biāo)志性分子CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞在細(xì)胞免疫中起核心作用，對(duì)于維持免疫耐受及免疫平衡具有重要作用，病毒在體內(nèi)不能徹底清除，組織損傷遷延不愈等都與機(jī)體的免疫耐受息息相關(guān)，因此，檢測(cè)外周血CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞的水平可以較好地反映患者的免疫功能狀態(tài)[3-4]。在慢性乙型肝炎、人類免疫缺陷病毒等慢性感染中發(fā)現(xiàn)，CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞比例升高，并調(diào)節(jié)病毒特異T細(xì)胞應(yīng)答[5-6]。在HCV慢性感染中，調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞與疾病進(jìn)展的關(guān)系有不少的研究，但由于研究對(duì)象和手段的不同，結(jié)果也不一致。陳瑜等[7]研究認(rèn)為，外周血CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞與療效相關(guān)，可作為肝衰竭療效評(píng)估及預(yù)后判定的指標(biāo)。彭明喜等[8]認(rèn)為，現(xiàn)癥慢性化的HCV感染CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞水平較高。但由于研究對(duì)象及手段不同，導(dǎo)致的結(jié)果并不一致；對(duì)早期的HCV感染中，CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞水平的研究還較少。本研究是以早期的HCV感染中病毒載量與CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞相關(guān)性進(jìn)行探討，以CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞水平分析其在HCV致病中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集22例HCV Ag陽(yáng)性、抗-HCV陰性的早期感染病例；26例核心抗原陰性、抗體陽(yáng)性的既往HCV感染病例；24例HCV Ag陽(yáng)性、抗-HCV陽(yáng)性的慢性HCV感染病例及22例健康者作健康對(duì)照組。

1.2 酶聯(lián)免疫吸咐試驗(yàn)(ELISA)篩選HCV抗原和抗體 采用雙抗體(抗原)夾心ELISA。丙型肝炎核心抗原檢測(cè)試劑由基因重組表達(dá)的丙型肝炎病毒核心區(qū)抗原(HCV-cAg)免疫制備的抗丙型肝炎病毒核心單克隆抗體包被微孔板、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)志抗體(抗原)及陽(yáng)性、陰性對(duì)照等組成，應(yīng)用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)人血清或血漿樣品中丙型肝炎病毒核心抗原(抗體)，按操作說(shuō)明進(jìn)行操作。用CUT OFF值來(lái)判讀結(jié)果(CUT OFF=2.1×陰性對(duì)照，≥CUT OFF值為陽(yáng)性)。檢測(cè)儀器為雷杜RT6100酶標(biāo)儀；試劑由珠海麗珠生物工程有限公司生產(chǎn)；ELISA試劑盒。

1.3 FQ RT-PCR檢測(cè)丙型肝炎的病毒載量 (1)樣品RNA的抽提：標(biāo)準(zhǔn)或陰、陽(yáng)性對(duì)照和待測(cè)血清100 μL加入100 μL RNA提取液1，13 000 r/min離心10 min，棄上清液后加25 μL提取液2完全溶解。(2)樣品cDNA合成：反應(yīng)體系10 μL混合液在加入逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV之前先70 ℃干浴3 min，取出后立即冰水浴至管內(nèi)外溫度一致，然后加逆轉(zhuǎn)錄酶0.5 μL，37 ℃水浴60 min，取出后立即95 ℃干浴3 min，得到逆轉(zhuǎn)錄終溶液即為cDNA溶液。(3)加樣：在預(yù)定的反應(yīng)管中加入相應(yīng)體積的反應(yīng)體系38 μL；所定的反應(yīng)分別加入樣本、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照和臨界陽(yáng)性對(duì)照及標(biāo)準(zhǔn)工作品各2 μL于4 000 r/min離心5 s，至檢測(cè)區(qū)(PCR儀上)。(4)PCR抗增：反應(yīng)條件為37 ℃ 5 min，94 ℃ 1 min，然后95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)，熒光信號(hào)收集時(shí)設(shè)定為Fam熒光素，信號(hào)收集為60 ℃，儀器自動(dòng)判讀結(jié)果；儀器為美國(guó)ABI型PCR擴(kuò)增儀，由電腦自動(dòng)分析計(jì)算HCV RNA定量結(jié)果；結(jié)果以copy/mL表示。HCV RNA試劑盒由深圳凱杰生物工程有限公司生產(chǎn)。

1.4 流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞水平及百分率 用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管(美國(guó)BD公司)采集全血，密度梯度離心機(jī)分離HCV感染者及健康對(duì)照外周血中單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)。Foxp3+細(xì)胞的檢測(cè)應(yīng)用異硫氰酸熒光素(FITC)抗人Foxp3染色試劑盒(美國(guó)eBioscience公司)進(jìn)行細(xì)胞染色，用BD公司的FACSCalibur流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組中CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞，具體方法如下：向流式1×106個(gè)PBMC中加入CD4-APC-Cy7抗體、CD25-APC抗體、CD3-PE-Cy7抗體(美國(guó)BD公司)40 ℃避光染色30 min，用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)洗滌后加入1 mL的破膜/固定劑，40 ℃避光染色40 min，洗滌后加入2%(2 μL)的鼠血清，40 ℃避光15 min，加入Foxp3-FITC抗體及同型對(duì)照，40 ℃避光30 min，洗滌后加入含1%聚甲醛的PSB重懸液，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析，以FSC、SSC、CD3-PE-Cy7、CD4-APC-Cy7定義淋巴細(xì)胞，計(jì)算這一群內(nèi)的CD25+Foxp3+細(xì)胞比率，CD4+T淋巴細(xì)胞絕對(duì)值用BD公司TruCOUNT管FACSCalibur流式細(xì)胞儀測(cè)定，調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞絕對(duì)值=CD4+T淋巴細(xì)胞絕對(duì)值×調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞比率，美國(guó)BD公司原廠試劑。

2 結(jié) 果

2.1 研究對(duì)象臨床資料及實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果 見表1。

表1 4組研究對(duì)象臨床及實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果±s)

注：-表示無(wú)數(shù)據(jù)。

2.2 HCV Ag陽(yáng)性、抗-HCV陰性組CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞水平 通過(guò)單細(xì)胞水平檢測(cè)外周血PBMC中CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞水平發(fā)現(xiàn)，HCV Ag陽(yáng)性、抗-HCV陰性組，HCV Ag陽(yáng)性、抗-HCV陽(yáng)性組，HCV Ag陰性、抗-HCV陽(yáng)性組以及健康對(duì)照組CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞逐級(jí)下降，其中，抗原陽(yáng)性、抗體陰性組[(4.86±2.14)%]高于其他組[分別為(3.74±1.67)%、(2.74±1.27)%、(2.56±1.18)%]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為2.023、4.125、4.402；P分別為0.049、0.000、0.000，P<0.05)。

2.3 病毒載量 HCV Ag陽(yáng)性、抗-HCV陰性組(4.18±1.70)，HCV Ag陽(yáng)性、抗-HCV陽(yáng)性組(3.80±1.40)，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，分別與HCV Ag陽(yáng)性、抗-HCV陰性組，HCV Ag陽(yáng)性、抗-HCV陽(yáng)性組中CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞水平相關(guān)(r=0.535、0.452,P<0.05)。兩組間HCV RNA比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.846，P>0.05)。

3 討 論

CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞作為天然調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞，是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的主要組成成分，F(xiàn)oxp3是調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞較為特異的標(biāo)志，與調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞的功能密切相關(guān)，是定義CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞的最佳標(biāo)志物。近年來(lái)，HCV感染呈上升趨勢(shì)，慢性化程度高，對(duì)肝臟損害嚴(yán)重，目前尚無(wú)特效藥及疫苗對(duì)丙型肝炎進(jìn)行預(yù)防或治療。當(dāng)前認(rèn)為HCV免疫耐受的機(jī)制可能不僅與病毒和宿主兩方面的因素有關(guān)，而且與病毒的基因、病毒變異、病毒載量以及宿主的年齡、種族、基因多態(tài)性、樹突狀細(xì)胞抗原遞呈功能低下等因素有關(guān)[9-10]。在抗病毒治療中，病毒血癥被有效抑制，但CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞不升高的感染者。因此，在HCV感染早期尋找免疫耐受機(jī)制對(duì)治療和探索新的免疫靶細(xì)胞具有非常重要的意義。近年來(lái)，CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞在HCV感染發(fā)病機(jī)制中的作用越來(lái)越受到重視，一方面，CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞能抑制機(jī)體的過(guò)度免疫損傷；另一方面，CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞也可能有利于HCV持續(xù)的感染。本研究分別以HCV早期、既往、慢性感染者外周血為樣本，用PCR技術(shù)檢測(cè)HCV RNA病毒載量及用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞水平，探討CD4+CD25+Foxp3+與HCV病毒載量的相關(guān)性，分析HCV早期感染的免疫調(diào)節(jié)作用，了解丙型肝炎病毒清除情況及丙型肝炎慢性化進(jìn)程，為臨床有效治療和預(yù)防丙型肝炎病毒感染提供新的線索和方法。調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞是維持機(jī)體平衡的重要因素，在HCV感染早期，其與病毒進(jìn)展的關(guān)系備受關(guān)注，但研究的結(jié)果并不一致。HCV感染早期，病毒與宿主的相互作用已決定了疾病的預(yù)后，這一時(shí)期的免疫應(yīng)答對(duì)于了解其在HCV感染疾病進(jìn)程發(fā)揮的作用具有重要意義。

本研究通過(guò)研究早期HCV感染者Treg的變化，探討其在疾病進(jìn)展中發(fā)揮的作用，結(jié)果顯示，HCV Ag陽(yáng)性、抗-HCV陰性組，HCV Ag陽(yáng)性、抗-HCV陽(yáng)性組，HCV Ag陰性、抗-HCV陽(yáng)性組及健康對(duì)照組CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞逐級(jí)下降，HCV Ag陽(yáng)性、抗-HCV陰性組[(4.86±2.14)%]與各組比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且與HCV RNA呈正相關(guān)(r=0.535，P<0.05),提示HCV感染者體內(nèi)的免疫系統(tǒng)功能受到抑制，CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞可能會(huì)促進(jìn)病毒的應(yīng)答不完全，不能及時(shí)、有效地清除病毒，促使HCV的復(fù)制，這是導(dǎo)致丙型肝炎慢性化發(fā)展的一個(gè)因素。由于CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞可以抑制多種效應(yīng)功能，因此可以推測(cè)，感染HCV后，TregCD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞百分率升高，使CD4+細(xì)胞群中抑制性細(xì)胞比例升高，對(duì)效應(yīng)細(xì)胞有抑制作用，削弱抗病毒免疫，從而與高水平的病毒調(diào)定點(diǎn)有關(guān)，導(dǎo)致了HCV的持續(xù)感染；也可能是在HCV感染的免疫調(diào)節(jié)中，CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞的存在，使機(jī)體的效應(yīng)細(xì)胞和HCV之間維持機(jī)體的保護(hù)性免疫，避免過(guò)度激發(fā)免疫反應(yīng)而造成周圍組織的損傷，但也會(huì)造成HCV的持續(xù)存在，促進(jìn)了丙型肝炎慢性化進(jìn)程，具體的免疫機(jī)制有待進(jìn)一步研究[11]。

綜上所述，早期HCV感染者CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞的百分率與病毒載量有關(guān)，是評(píng)價(jià)早期HCV感染進(jìn)展的指標(biāo)之一，為進(jìn)一步探討HCV的致病機(jī)制及其與宿主免疫應(yīng)答的相互關(guān)系提供了線索。

[1]Sakaguchi S,Wing K,Yamaguchi T.Dynamics of peripheral tolerance and immune regulation mediated by Treg[J].Eur J Immunol,2009,39(9):2331-2336.

[2]Moriishi K,Matsuura Y.Pathogenesis of hepatitis C virus[J].Uirusu,2007,57(2):141-149.

[3]Murphy TJ,Ni Choileain N,Zang Y,et al.CD4+CD25+regulatory T cells control innate immune reactivity after injury[J].J Immunol,2005,174(5):2957-2963.

[4]張子寧,胡斯文,徐俊杰,等.中國(guó)HIV早期感染者CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞變化研究[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2011,34(8):712-716.

[5]卿克勤,楊朝國(guó),劉蓉.慢性乙型肝炎患者外周血CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞變化水平及其與抗病毒療效的關(guān)系[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué),2013,28(9):811-814.

[6]Elpek KG,Yoleu ES,Franke DD,et al.Ex vivo expansion of CD4+CD25+Foxp3+T regulatory cells based on synergy between IL-2 and 4-1BB signaling[J].J Immunol,2007,179(11):7295-7304.

[7]陳瑜,毛衛(wèi)林,俞炯,等.肝衰竭患者外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞水平變化與療效的相關(guān)性研究[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2007,30(8):854-857.

[8]彭明喜,張哲,許德義,等.HCV感染者外周血CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的檢測(cè)及意義[J].浙江醫(yī)學(xué),2009,7(2):38-40.

[9]Rehermann B,Nascimbeni M.Immunology of hepatitis B virus and hepatitis C virus infection[J].Nat Rev Immunol,2005,5(3):215-229.

[10]Fontenot JD,Rudensky AY.A well adapted regulatory contrivance:regulatory T cell development and the forkhead family transcription factor Foxp3[J].Nat Immunol,2005,6(4):331-337.

[11]Fazekas B,Landay AL.Regulatory T cells in HIV infection: pathogenic or protective participants in the immune response[J].Aids,2008,22(6):671-683.

The correlation study between viral load in the early HCV-infected patients and CD4+CD25+Foxp3+regulatory T cells*

HUANGQi-qiang，HUANGLi-qing，ZHOUQing，XIAOHan，HUANGHuo-rong，HUShu-yan

(TheFifthAffiliatedHospitalofZunyiMedicalUniversity,Zhuhai,Guangdong519100，China)

Objective To study the correlation between HCV viral load in the early HCV-infected patients(antigen-positive antibody-negative) and CD4+CD25+Foxp3+regulatory T cells,and to know the function of CD4+CD25+Foxp3+regulatory T lymphocytes in the HCV infections.Methods We will use the real-time quantitative polymerase chain reaction(FQ RT-PCR) technique to detect HCV RNA viral load in 22 cases of early infected patients with HCV core positive antigen negative antibody(positive HCV Ag,negative HCV Ab),26 cases of chronic HCV-infected patients with core positive antigen and positive antibody (positive HCV Ag,positive HCV Ab),24 cases of following HCV-infected patients with core negative antigen positive antibody (negative HCV Ag,positive HCV Ab) and 22 cases healthy controls.We also will use flow cytometry technique to detect the level of CD4+CD25+Foxp3+regulatory T lymphocytes of nucleated cells in peripheral blood in each group.Results The CD4+CD25+Foxp3+regulatory T lymphocytes in the group of positive HCV Ag negative HCV Ab,the group of positive HCV Ag positive HCV Ab,the group of negative HCV Ag positive HCV Ab and healthy control group is step-down,of which the group of original positive antibody negative antigen (4.86±2.14)% is higher than other groups(3.74±1.67)%，(2.74±1.27)%，(2.56±1.18)%.The difference is statistically significant(tvalues were 2.023,4.125,4.402,P<0.05);CD4+CD25+Foxp3+regulatory T lymphocytes and HCV RNA viral load logarithmic (copy/mL,Ig) were positively correlated(r=0.535,P<0.05) in core positive antigen negative antibody group.Conclusion The level of CD4+CD25+Foxp3+regulatory T lymphocytes in HCV early infections is associated with the set-point of high virus.CD4+CD25+Foxp3+regulatory T lymphocytes level may be one of the factors to speed up the early HCV infection.

HCV; early infection; regulatory T lymphocytes; viral load; relevance

廣東省醫(yī)學(xué)科研基金課題(A2013647)。

黃啟強(qiáng)，男，副主任檢驗(yàn)師，本科，主要從事免疫微生物學(xué)檢驗(yàn)方面的研究。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.08.008

A

1672-9455(2015)08-1045-03

2014-11-05

2015-01-17)