陳 富，李岳軍，周 強(qiáng)，廖煥蘭，許振杰，陳中華

(廣東省中醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣州 510120)

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·論 著·

286株銅綠假單胞菌耐藥譜及其Ⅰ類整合子的相關(guān)性研究*

陳 富，李岳軍，周 強(qiáng)△，廖煥蘭，許振杰，陳中華

(廣東省中醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣州 510120)

目的 通過分析2013年分離的286株銅綠假單胞菌對16種抗菌藥物的耐藥情況,明確Ⅰ類整合子在銅綠假單胞菌多重耐藥中所起的作用。方法 采用紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥物敏感試驗(yàn)，并以聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)進(jìn)行Ⅰ類整合子的檢測，用χ2檢驗(yàn)對Ⅰ類整合子攜帶率與銅綠假單胞菌多重耐藥的相關(guān)性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果 在分離出的286株細(xì)菌中，檢出Ⅰ類整合子89株，檢出率為31.1%；Ⅰ類整合子陽性株對多種抗菌藥物的耐藥率明顯高于整合子陰性株。結(jié)論 銅綠假單胞菌的耐藥情況嚴(yán)重，Ⅰ類整合子是銅綠假單胞菌多重耐藥的重要因素。

銅綠假單胞菌； Ⅰ類整合子； 多藥耐藥

銅綠假單胞菌是目前引起人類感染的最重要的條件致病菌之一，僅次于大腸埃希菌，在醫(yī)院感染中占了很重要的地位，特別是由于近年來抗菌藥物的廣泛應(yīng)用，其耐藥情況日益嚴(yán)峻，對醫(yī)院抗感染的治療增加了難度。引起銅綠假單胞菌多重耐藥的原因多種多樣，其耐藥機(jī)制主要涉及整合子、外膜通透性障礙、作用靶位改變、產(chǎn)生滅活酶、形成生物膜和主動(dòng)外排泵系統(tǒng)等，而整合子高效的整合和表達(dá)作用使其在細(xì)菌耐藥傳播中起著重要的作用[1]。目前發(fā)現(xiàn)的整合子中與細(xì)菌的耐藥機(jī)制有密切關(guān)系的主要有3類，其中Ⅰ類整合子在多重耐藥的細(xì)菌中最為常見，并在耐藥性方面起著重要作用。因此本文通過對本院2013年臨床分離的286株銅綠假單胞菌進(jìn)行耐藥譜研究和Ⅰ類整合子的檢測，進(jìn)一步探討Ⅰ類整合子與銅綠假單胞菌耐藥的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 菌株和鑒定 本實(shí)驗(yàn)菌株均是本院2013年1～12月的初次分離株，共286例，采用VITEK-32全自動(dòng)微生物鑒定儀進(jìn)行菌種鑒定。

1.2 藥敏試驗(yàn) 采用美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(CLSI)推薦的標(biāo)準(zhǔn)方法(K-B紙片法)，由英國Oxoid公司提供的16種藥敏試紙對亞胺培南、美羅培南、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、氨芐西林、氨芐西林/舒巴坦、頭孢吡肟、頭孢唑啉、頭孢他啶、慶大霉素、丁胺卡那霉素、復(fù)方磺胺甲噁唑、呋喃妥因、頭孢曲松等進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。

1.3 設(shè)計(jì)引物與PCR擴(kuò)增檢測Ⅰ類整合子 根據(jù)文獻(xiàn)和pubmed檢索設(shè)計(jì)intⅠ1引物：5′-GGG TCA AGG ATC TGG ATT TCG-3′，3′-ACA TGC GTG TAA ATC ATC GTC G-5′。通過對所收集菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳后檢測擴(kuò)增產(chǎn)物并進(jìn)行DNA測序。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 全部藥敏結(jié)果采用世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦的細(xì)菌耐藥性監(jiān)測軟件WHONET 5.4，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 銅綠假單胞菌中Ⅰ類整合子的檢測結(jié)果 286例銅綠假單胞菌中檢出Ⅰ類整合子89例，檢出率為31.1%，見圖1。

圖1 銅綠假單胞菌Ⅰ類整合子的凝膠電泳圖

2.2 286例銅綠假單胞菌的耐藥譜 見表1。所有菌株對亞胺培南和美羅培南敏感率最高，Ⅰ類整合子陽性株對多種抗菌藥物的耐藥率明顯高于Ⅰ類整合子陰性株，其中Ⅰ類整合子陽性株中的頭孢吡肟、頭孢唑啉、慶大霉素和呋喃妥因全部耐藥。

表1 銅綠假單胞菌的耐藥譜

2.3 DNA測序結(jié)果 選?、耦愓献拥年栃詳U(kuò)增產(chǎn)物2例純化后直接雙向測序，結(jié)果顯示，Ⅰ類子擴(kuò)增片段大小為484 bp，與預(yù)期擴(kuò)增片段大小相符，經(jīng)GenBank數(shù)據(jù)庫同源性比對，與庫中的Ⅰ類整合子的同源性均為100%。

3 討 論

銅綠假單胞菌作為目前引起醫(yī)院感染的常見菌，可引起呼吸道病房、重癥監(jiān)護(hù)室等重癥患者病區(qū)醫(yī)院感染的爆發(fā)[2]，但銅綠假單胞菌的耐藥率卻不斷升高，所以近年來對于細(xì)菌的耐藥問題已引起醫(yī)學(xué)界的嚴(yán)重關(guān)注。當(dāng)務(wù)之急就是要找出引起耐藥的基因或傳播基因，深究耐藥的源頭。近年來國內(nèi)外有大量的文獻(xiàn)報(bào)道，整合子可介導(dǎo)各種耐藥基因，可以在同種細(xì)菌菌株之間甚至不同種細(xì)菌菌株之間傳遞[3-4]，整合子在耐藥機(jī)制中就扮演著重要的角色，其中Ⅰ類整合子起著主要的作用。因此，有必要將本院銅綠假單胞菌感染的標(biāo)本進(jìn)行Ⅰ類整合子的檢測及耐藥情況分析。

本組通過對進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的16種抗菌藥物的耐藥率的比較可發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)對亞胺培南(16.1%)和美羅培南(14.7%)的耐藥率最低，比孫珊等[5]報(bào)道的結(jié)果還低。而頭孢唑啉和呋喃妥因的耐藥率較高，達(dá)到70%以上；頭孢吡肟、頭孢曲松、慶大霉素、環(huán)丙沙星、復(fù)方磺胺甲噁唑等的耐藥率都超過50%，常見的這幾種藥的耐藥率都如此高，給臨床的用藥選擇增加了難度。

在對留取的286例銅綠假單胞菌的Ⅰ類整合子的檢測中，總檢出89株，檢出率為31.1%，比國內(nèi)其他地區(qū)的報(bào)道還低一點(diǎn)[6-7]，可能由于本院是中醫(yī)院，抗菌藥物與中藥的混合使用，與各地區(qū)的抗菌藥物的使用習(xí)慣不同和標(biāo)本的類型不同引起。按照目前各地區(qū)的抗菌藥物的使用情況，隨著時(shí)間的推移，Ⅰ類整合子的檢出率也會(huì)不斷增高[8]。

對比Ⅰ類整合子陽性和陰性株的耐藥譜可發(fā)現(xiàn)，Ⅰ類整合子陽性菌株的頭孢吡肟、頭孢唑啉、慶大霉素和呋喃妥因的耐藥率達(dá)100.0%；而環(huán)丙沙星和左氧氟沙星的耐藥率超過80%；其他的耐藥率也比Ⅰ類整合子陰性株的耐藥率高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由此可以推斷Ⅰ類整合子可能就是銅綠假單胞菌耐藥增加的重要原因[9]。而Ⅰ類整合子陽性菌株中的頭孢吡肟、頭孢唑啉、慶大霉素和呋喃妥因全部耐藥，說明Ⅰ類整合子嚴(yán)重地影響著銅綠假單胞菌的耐藥情況，在以后的治療中必須非常注意是否為Ⅰ類整合子的菌株感染。

總之，由于銅綠假單胞菌的耐藥水平不斷增高，感染所導(dǎo)致的治療的難度也會(huì)越來越高。本文只研究了銅綠假單胞菌的Ⅰ類整合子所引起的耐藥水平，而其他更多的耐藥機(jī)制并未涉及[1]，因此，除了合理地選擇抗菌藥物的使用外，找出銅綠假單胞菌耐藥的機(jī)制則更為重要。

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[2]施夢萍,章可謂.臨床分離的銅綠假單胞耐藥性檢測[J].中國消毒學(xué)雜志，2010，27(4)：439-440.

[3]章清,魏麗,王金鐸.多耐藥銅綠假單胞菌可移動(dòng)遺傳元件研究[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2010，20(18)：2742-2745.

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[5]孫珊,張莉萍.1 274株銅綠假單胞菌在臨床細(xì)菌感染中的分布及耐藥性分析[J].重慶醫(yī)學(xué),2011，40(3)：226-228.

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Study on correlation between drug resistance spectrum and class Ⅰ integron in 286 strains of Pseudomonas aeruginosa*

CHENFu,LIYue-jun,ZHOUQiang△,LIAOHuan-lan,XUZhen-jie,CHENZhong-hua

(DepartmentofClinicalLaboratory,GuangdongProvincialHospitalofTraditionalChineseMedicine,Guangzhou,Guangdong510120,China)

Objective To clarify the role of class Ⅰ integron in multi-drug resistance of Pseudomonas aeruginosa by analyzing the resistance situation of 286 strains of Pseudomonas aeruginosa isolated from our hospital in 2013 to 16 kinds of antibacterial drugs.Methods The drug susceptibility test was performed by the K-B test.The class Ⅰ integron gene was detected by PCR.The correlation between the class Ⅰ integron carrying rate and multi-drug resistance of Pseudomonas aeruginosa was statistically analyzed with chi-square test.Results In isolated 286 strains of Pseudomonas aeruginosa,89 strains were the class Ⅰ integron with the detection rate of 31.1%;the resistance rate to various antimicrobial agents in class Ⅰ integron-positive strains was significantly higher than that in integron-negative strains.Conclusion The drug resistance situation in Pseudomonas aeruginosa is serious.The classⅠ integron is an important factor in multi-drug resistance of Pseudomonas aeruginosa.

Pseudomonas aeruginosa; class Ⅰ integron; multidrug-resistance

廣東省科技廳科研項(xiàng)目(2011B031800028)。

陳富，男，主管技師，大學(xué)本科，主要從事臨床檢驗(yàn)工作。△

，E-mail:13631412228@163.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.02.007

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1672-9455(2015)02-0157-02

2014-05-27

2014-10-23)