盧 婷，李發(fā)科，羅 杰，楊邵俊，潘 鋒，章明徐,陳 鳴

(第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所檢驗(yàn)科，重慶 400042)

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·論 著·

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)乙型肝炎病毒血清學(xué)標(biāo)志物的性能評(píng)價(jià)*

盧 婷，李發(fā)科，羅 杰，楊邵俊，潘 鋒，章明徐,陳 鳴△

(第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所檢驗(yàn)科，重慶 400042)

目的 通過(guò)檢測(cè)乙型肝炎病毒(HBV)血清學(xué)標(biāo)志物，對(duì)ADDCAER1100全自動(dòng)酶免工作站進(jìn)行定性試驗(yàn)的性能評(píng)價(jià)。方法 根據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(NCCLS)頒布的EP12-A文件，以Architect I2000全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀(簡(jiǎn)稱(chēng)Architect I2000)為參考方法，對(duì)ADDCAER1100全自動(dòng)酶免工作站(簡(jiǎn)稱(chēng)ADDCAER1100)進(jìn)行HBV血清學(xué)標(biāo)志物檢測(cè)的方法學(xué)對(duì)比及重復(fù)性試驗(yàn)，完成其定性試驗(yàn)的性能評(píng)價(jià)。結(jié)果 方法學(xué)比較顯示，HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb的總符合率分別為99.0%、99.5%、99.5%、98.0%、100.0%；陽(yáng)性符合率分別為98.0%、100.0%、99.0%、97.0%、100.0%，陰性符合率分別為100.0%、99.0%、100.0%、99.0%、100.0%，Kappa系數(shù)分別為0.98、0.99、0.99、0.96,1.00。重復(fù)性試驗(yàn)顯示，HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb±20%濃度的臨界值樣本陽(yáng)(陰)性率均不小于95%，95%置信區(qū)間分別為：96.6%～99.5%、97.6%～99.5%、97.6%～99.5%、94.7%～99.5%、98.6%～99.5%。結(jié)論 ADDCAER1100與Architect I2000檢測(cè)HBV血清學(xué)標(biāo)志物的結(jié)果一致性較強(qiáng)，ADDCAER1100檢測(cè)HBV血清學(xué)標(biāo)志物在臨界值±20%的濃度內(nèi)能得到穩(wěn)定結(jié)果。該儀器的性能可靠，可用于標(biāo)本的檢測(cè)。

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)； 定性試驗(yàn)； 性能評(píng)價(jià)； 乙型肝炎病毒； 血清學(xué)標(biāo)志物

我國(guó)是乙型肝炎病毒(HBV)感染的高發(fā)國(guó)家，現(xiàn)有慢性HBV感染者約9 300萬(wàn)人，其中慢性乙型肝炎患者約2 000萬(wàn)人[1]。臨床試驗(yàn)室已開(kāi)展了多種HBV血清學(xué)標(biāo)志物的檢測(cè)方法，其中化學(xué)發(fā)光法是定量檢測(cè)HBV血清學(xué)標(biāo)志物的高靈敏度和高特異性的方法。以酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)為代表的定性方法因具有靈敏度和特異性高、操作簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)，也一直是臨床試驗(yàn)室檢測(cè)HBV抗原、抗體的常用方法，同時(shí)是各級(jí)醫(yī)院檢驗(yàn)科的必備方法。ADDCAER1100全自動(dòng)酶免工作站是一種基于ELISA的全自動(dòng)血清標(biāo)志物定性檢測(cè)平臺(tái)，其HBV血清學(xué)標(biāo)志物檢測(cè)性能未知。本研究根據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(NCCLS)文件EP12-A，結(jié)合臨床試驗(yàn)室實(shí)際情況，以HBV血清學(xué)標(biāo)志物乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎表面抗體(HBsAb)、乙型肝炎e抗原(HBeAg)、乙型肝炎e抗體(HBeAb)、乙型肝炎核心抗體(HBcAb)測(cè)定為例，以Architect I2000全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀為參考方法，對(duì)ADDCAER1100全自動(dòng)酶免工作站進(jìn)行性能評(píng)價(jià)，通過(guò)重復(fù)性試驗(yàn)和方法學(xué)對(duì)比評(píng)價(jià)該系統(tǒng)的檢測(cè)性能[2]，以保證臨床標(biāo)本檢測(cè)的準(zhǔn)確性和可靠性。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 收集2012年12月至2013年5月本院門(mén)診、病房和體檢檢測(cè)HBV血清學(xué)標(biāo)志物的血清標(biāo)本1 000例，包括5種HBV血清學(xué)標(biāo)志物(HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb)的陽(yáng)性和陰性標(biāo)本各100例。

1.2 試劑和儀器 采用儀器為煙臺(tái)艾德康A(chǔ)DDCAER1100全自動(dòng)酶免工作站，配套試劑為北京萬(wàn)泰生產(chǎn)的HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb的ELISA試劑盒；美國(guó)雅培Architect I2000全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀及其配套試劑、定標(biāo)品。質(zhì)控品為衛(wèi)生部臨檢中心提供的0.2 IU/mL HBsAg、30 IU/mL HBsAb、2 NCU/mL HBeAg、4 NCU/mL HBeAb、4 NCU/mL HBcAb的質(zhì)控血清。

1.3 方法

1.3.1 方法學(xué)的對(duì)比 參考EP12-A文件設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案，以 Architect I2000為參考方法，ADDCAER1100為對(duì)比方法。分別選取HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb陽(yáng)性和陰性標(biāo)本各100份，用以上兩臺(tái)設(shè)備進(jìn)行檢測(cè)，方法學(xué)比較在10 d內(nèi)完成，按照受試者血清標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)。每次試驗(yàn)低值質(zhì)控品重復(fù)檢測(cè)2次，總共檢測(cè)20次，任何一次低值質(zhì)控品失控，立即停止試驗(yàn)，該批標(biāo)本檢測(cè)數(shù)據(jù)視為無(wú)效，應(yīng)在當(dāng)天或第2天重新測(cè)量，最后比較兩套檢測(cè)方法結(jié)果的一致性。

1.3.2 重復(fù)性試驗(yàn) 參考EP12-A文件設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案，每次試驗(yàn)均設(shè)立陰陽(yáng)性對(duì)照(試劑盒內(nèi)自帶)，試驗(yàn)在10 d完成，有雙份陰陽(yáng)性對(duì)照，共計(jì)20份陰陽(yáng)性對(duì)照結(jié)果。將已知濃度的5種HBV血清學(xué)標(biāo)志物低值質(zhì)控血清進(jìn)行系列稀釋?zhuān)宽?xiàng)稀釋結(jié)果在ADDCAER1100上檢測(cè)20次，找到陰陽(yáng)性結(jié)果各占50%的標(biāo)本，可確定該標(biāo)本濃度為臨界值(cut off值)濃度。配置5種HBV血清學(xué)標(biāo)志物濃度為臨界值±20%的分析物，分別在ADDCAER1100上測(cè)定20次，記錄結(jié)果。臨界值95%置信區(qū)間(CI)的結(jié)果判定以樣本/臨床值比值(S/CO值)表示：HBsAg、HBsAb、HBeAg的S/CO≥1為陽(yáng)性，S/CO<1為陰性；HBeAb、HBcAb的S/CO<1為陽(yáng)性，S/CO≥1為陰性。+20%濃度臨界值的分析物檢測(cè)陽(yáng)性率不小于95%，同時(shí)-20%濃度臨界值的分析物檢測(cè)陰性率不小于95%，說(shuō)明臨界值±20%的濃度位于該檢測(cè)方法的95%CI內(nèi)[2]。

2 結(jié) 果

2.1 方法學(xué)比較 兩套檢測(cè)系統(tǒng)的一致性結(jié)果顯示：HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb的總符合率分別為99.0%、99.5%、99.5%、98.0%、100.0%，陽(yáng)性符合率分別為98.0%、100.0%、99.0%、97.0%、100.0%，陰性符合率分別為100.0%、99.0%、100.0%、99.0%、100.0%，Kappa系數(shù)分別為0.98、0.99、0.99、0.96、1.00。見(jiàn)表1～5。

表1 HBsAg檢測(cè) 的方法學(xué)對(duì)比

表2 HBsAb檢測(cè)的方法學(xué)對(duì)比

表3 HBeAg檢測(cè)的方法學(xué)對(duì)比

表4 HBeAb檢測(cè)的方法學(xué)對(duì)比

表5 HBcAb檢測(cè)的方法學(xué)對(duì)比

2.2 重復(fù)性試驗(yàn) ADDCAER1100檢測(cè)設(shè)備重復(fù)性試驗(yàn)顯示：HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb低值質(zhì)控品分別稀釋4、3、3.4、1.6、1.7倍的濃度為其臨界值濃度，±20%濃度臨界值標(biāo)本陽(yáng)(陰)性率均不小于95%，95%CI分別為：96.6%～99.5%、97.6%～99.5%、97.6%～99.5%、94.7%～99.5%、98.6%～99.5%。CV批內(nèi)均在10%左右，CV批間均小于15%。見(jiàn)表6。

表6 ADDCAER1100檢測(cè)儀HBV血清學(xué)標(biāo)志物 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

注：-20%為臨界值-20% 分析物濃度；+20%為臨界值+20% 分析物濃度。

3 討 論

本研究以HBV血清學(xué)標(biāo)志物HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb為例，進(jìn)行方法學(xué)對(duì)比和重復(fù)性試驗(yàn)，用于ELISA的方法學(xué)評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示：在方法學(xué)對(duì)比中，以化學(xué)發(fā)光法為原理的Architect I2000和ELISA為原理的ADDCAER1100同時(shí)檢測(cè)HBV血清學(xué)標(biāo)志物的結(jié)果一致性較強(qiáng)；在重復(fù)性試驗(yàn)中HBV血清學(xué)標(biāo)志物標(biāo)本濃度在±20%臨界值標(biāo)本位于95%CI內(nèi)，對(duì)于臨界濃度不小于20%的標(biāo)本也能得到穩(wěn)定的結(jié)果。

在臨床試驗(yàn)室使用新的試劑、系統(tǒng)或更換試劑、系統(tǒng)時(shí)，為了保證標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，在開(kāi)展檢測(cè)項(xiàng)目前需要進(jìn)行性能評(píng)價(jià)。在性能評(píng)價(jià)的方法學(xué)對(duì)比中，定性試驗(yàn)通常運(yùn)用2種或2種以上的檢測(cè)方法(儀器)。由于最終的診斷結(jié)果未知，或無(wú)診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，定性方法又分為已知診斷的定性試驗(yàn)和未知診斷的定性試驗(yàn)，未知診斷的定性試驗(yàn)往往對(duì)比幾種檢測(cè)方法的一致性，采用幾種檢測(cè)方法的陰性和陽(yáng)性符合率表示[2-4]。本試驗(yàn)以HBV血清學(xué)標(biāo)志物檢測(cè)為例，以化學(xué)發(fā)光法為原理的Architect I2000作為參考儀器，以新引入科室的以ELISA為原理的ADDCARE1100為試驗(yàn)儀器。兩種方法學(xué)對(duì)比時(shí)，需注意標(biāo)本的選擇應(yīng)具有代表性，陽(yáng)性標(biāo)本應(yīng)該隨機(jī)選擇，用Kappa檢驗(yàn)判斷兩套檢測(cè)系統(tǒng)一致性的強(qiáng)弱[3-5]。

定性試驗(yàn)的重復(fù)性研究是檢驗(yàn)測(cè)量臨界值精密度的方法。檢測(cè)高值的陽(yáng)性標(biāo)本或陰性低值是不合適的，因?yàn)樗鼈兊慕Y(jié)果明顯超出了醫(yī)學(xué)決定值。而在臨界值附近同一份標(biāo)本常出現(xiàn)不一樣的結(jié)果[6]，本試驗(yàn)根據(jù)EP12-A文件的重復(fù)性試驗(yàn)方法，評(píng)估濃度在臨界值附近的標(biāo)本的精密度，通過(guò)重復(fù)測(cè)量±20%臨界值的標(biāo)本是否在該檢測(cè)方法的臨界值95%CI(重復(fù)測(cè)定臨界值附近的標(biāo)本，得到95%陽(yáng)性并且95%陰性的結(jié)果的濃度范圍，稱(chēng)為該檢測(cè)方法的臨界值的95%CI)來(lái)評(píng)價(jià)該試驗(yàn)方法的精密度[2]。

本研究在方法學(xué)對(duì)比中顯示兩套系統(tǒng)同時(shí)檢測(cè)HBV的5項(xiàng)血清學(xué)標(biāo)志物的結(jié)果一致性較強(qiáng)。在重復(fù)性試驗(yàn)中，±20%臨界值的標(biāo)本均在95%CI內(nèi)，對(duì)于臨界濃度不小于20%的標(biāo)本能夠得到穩(wěn)定的結(jié)果。臨界值的CV批內(nèi)值均在10%左右，CV批間<15%，說(shuō)明ADDCAER1100全自動(dòng)酶免工作站的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性符合臨床標(biāo)本檢測(cè)要求，可運(yùn)用于臨床HBV的檢測(cè)。

[1]中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病分會(huì)，中華醫(yī)學(xué)會(huì)感染學(xué)分會(huì)．慢性乙型肝炎防治指南(2010年版)[J]．中華肝臟病雜志，2011，19(1)：13-24．

[2]NCCLS．User protocol for evaluation of qualitative test performance proposed guideline[S]．Wayne，PA，USA：NCCLS，2002．

[3]夏邦世，吳金華．Kappa一致性檢驗(yàn)在檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用[J]．中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2006，29(1)：83-84．

[4]中國(guó)合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可委員會(huì)．CNAS CL39:醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則在臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域的應(yīng)用說(shuō)明[S]．北京：中國(guó)合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可委員會(huì)．2012．

[5]黃嫵嬌，黃憲章，莊俊華，等．CLSI EP12-A2文件在HBeAb定性檢測(cè)性能評(píng)價(jià)中的應(yīng)用[J]．檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2012，27(11)：900-903．

[6]陳桂三，張秀明，熊繼紅，等．未知診斷定性試驗(yàn)分析性能評(píng)價(jià)方法探討[J]．檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2010，25(12)：978-981．

Performance evaluation of ELISA for detecting HBV serological markers*

LUTing,LIFa-ke,LUOJie,YANGShao-jun,PANFeng,ZHANGMing-xu,CHENMing△

(DepartmentofClinicalLaboratory,DapingHospital,ResearchInstituteofFieldSurgery,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400042,China)

Objective To conduct the performance evaluation of the qualitative tests in the ADDCAER ELISA 1100 automated workstation by detecting the hepatitis B virus (HBV) serological markers.Methods According to EP12-A document promulgated by the National Committee for Clinical Laboratory(NCCLS),with the Architect I2000 automatic chemiluminescence immunoassay analyzer as the reference method,the methodological comparison and the repeatability test of the HBV serological markers detection by the ADDCARE ELISA automated workstation were performed for completing its qualitative test performance evaluation.Results The methodological comparison showed that of the total coincidence rate of HBsAg,HBsAb,HBeAg,HBeAb and HBcAb were 99.0%,99.5%,99.5%,98.0% and 100.0%,respectively;the positive coincidence rates were 98.0%,100.0%,99.0%,97.0% and 100.0%,respectively;the negative coincidence rate were 100.0%,99.0%,100.0%,99.0% and 100.0%,respectively;the Kappa values were 0.98,0.99,0.99,0.96 and 1.00 respectively.The repeatability tests showed that the positive(negative) rates of critical value in HBsAg,HBsAb,HBeAg,HBeAb and HBcAb within ±20% concentration ≥ 95%,the 95% confidence intervals were 96.6%-99.5%,97.6%-99.5%,97.6%-99.5%,94.7%-99.5% and 98.6%-99.5%,respectively.Conclusion The results of the ADDCAER ELISA 1100 automated workstation and the Architect I2000 automatic chemiluminescence immunoassay analyzer for detecting the HBV serological markers have strong consistency.The ADDCAER ELISA 1100 automated workstation for detect HBV serological markers obtains the stable results within ± 20% concentration near cutoff points and is reliable in performance,thus can be used to qualitatively detect HBV serological markers in clinical specimens.

enzyme-linked immunoadsordent assay； qualitative test； performance evaluation； hepatitis B virus； serological markers

衛(wèi)生部專(zhuān)項(xiàng)課題資助項(xiàng)目(28-1-5)。

盧婷，女，在讀碩士，初級(jí)檢驗(yàn)師，主要從事乙型肝炎傳染研究。△

，E-mail：chming1971@126.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.05.003

A

1672-9455(2015)05-0582-03

2014-10-20

2014-12-10)