葉景秀

(青海省農(nóng)林科學(xué)院，青海 西寧 810016)

小麥籽粒灌漿對(duì)產(chǎn)量及品質(zhì)至關(guān)重要。前人的工作主要集中在生理生化水平的研究上，例如分析不同因素對(duì)灌漿特性的影響［1-3］，淀粉的積累規(guī)律［4］，各種酶的變化規(guī)律等［5］。然而，籽粒的灌漿是一個(gè)復(fù)雜的生理生化過程，僅從生理生化水平無法深層次地揭示其機(jī)制。

目前，隨著植物蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)的日漸成熟，植物蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫的不斷更新，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在水稻［6］、小麥［7］、擬南芥［8］、大豆［9］、煙草［10］等作物中的研究報(bào)道日益增多。以植物蛋白質(zhì)的提取、雙向電泳分離、質(zhì)譜鑒定等先進(jìn)技術(shù)相結(jié)合，應(yīng)用于小麥蛋白質(zhì)組學(xué)的研究主要集中于小麥的根、葉片、花藥、花粉等組織器官蛋白質(zhì)的雙向電泳分析及相關(guān)蛋白質(zhì)功能的初步鑒定，然而，由于受籽粒中多糖等物質(zhì)的影響，較難提取籽粒總蛋白質(zhì)，影響了蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在籽粒中的應(yīng)用。在前人已發(fā)表的關(guān)于籽粒蛋白質(zhì)組學(xué)研究的文獻(xiàn)中，對(duì)不同作物所采取的蛋白質(zhì)提取方法各不相同。王慧娜等［11］在不同方法提取的小麥籽粒蛋白質(zhì)雙向電泳凝膠分離效果的分析比較一文中只介紹了提取方法對(duì)雙向電泳分離效果的影響，而影響雙向電泳效果的因素不僅僅是蛋白質(zhì)樣品的制備還包括蛋白質(zhì)上樣量、分離膠濃度、合適的膠條pH值等。因此，本研究對(duì)2種常用的植物組織蛋白質(zhì)提取方法進(jìn)行比較，并對(duì)雙向電泳過程中膠條pH值、蛋白質(zhì)上樣量和分離膠濃度等方面進(jìn)行優(yōu)化，以期探索出一套適合于小麥籽粒蛋白質(zhì)雙向電泳的技術(shù)體系，為今后開展小麥籽粒蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供技術(shù)支撐。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

小麥青春38為青海省農(nóng)林科學(xué)院自育品種，2013年種植于青海省農(nóng)林科學(xué)院試驗(yàn)地，按常規(guī)技術(shù)栽培管理，乳熟期和蠟熟期分別取穗中部籽粒，以液氮速凍，置－80℃冰箱保存。

1.2 儀器和試劑

PROTEAN IEF Cell等電聚焦系統(tǒng)、PROTEANⅡxi Cell垂直電泳系統(tǒng)、PDQuest 8.0.1凝膠圖像分析軟件均為美國Bio-Rad公司產(chǎn)品，UMAX Power-Look 2100XL光密度掃描儀為臺(tái)灣力捷公司產(chǎn)品，pH 4～7和pH 5～8線性IPG膠條、兩性電解質(zhì)等為Bio-Rad公司產(chǎn)品，苯甲基磺酰氟(PMSF)、β-巰基乙醇(β-ME)、二甲氨基丙磺酸(Chaps)、丙烯酰胺(Acrylamide)、甲叉雙丙烯酰胺(Bis-acrylamide)、四甲基乙二胺(TEMED)、二硫蘇糖醇(DTT)、過硫酸銨、碘乙酰胺、尿素為Sigma和Thermo公司產(chǎn)品，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 籽?？偟鞍踪|(zhì)的提取 TCA(三氯乙酸)/丙酮沉淀法:小麥籽粒加液氮研磨成粉末，參照陳蕊紅等［12］的TCA丙酮法提取總蛋白質(zhì)，略有改動(dòng)。用－20℃預(yù)冷蛋白質(zhì)提取液(8%TCA，0.07%β-ME，1 mmol/L PMSF)沉淀蛋白質(zhì)，置－20℃沉淀過夜，期間振蕩多次，4℃，14 000 r/min離心30 min，棄上清，沉淀用預(yù)冷丙酮溶液(含0.07% β-ME、1 mmol/L PMSF)洗滌，－20℃ 靜置1 h后，4℃、14 000 r/min離心30 min，重復(fù)4～5次，直至蛋白質(zhì)沉淀物為純白色，將沉淀真空冷凍成干粉，－80℃冰箱保存?zhèn)溆谩７犹崛》?小麥籽粒加液氮研磨成細(xì)粉，轉(zhuǎn)移至離心管加適量提取液(0.1 mol/L Tris-HCl，pH8.0，1%DTT，0.9 mol/L蔗糖，1 mmol/L PMSF)，攪勻，4℃放置5 min;4℃、14 000 g離心20 min，在上清液中加入等體積的 Tris飽和酚(pH 8.0)，充分振蕩混勻，4℃靜置1 h，離心(4℃，9 000 g，5 min)，收集酚相，加入3倍體積預(yù)冷的甲醇溶液(含0.1 mol/L醋酸銨)，混勻后－20℃過夜，4℃、18 000 g離心30 min，棄上清收集沉淀，沉淀用－20℃預(yù)冷丙酮溶液(含0.1%DTT)洗滌，離心(4℃，18 000 g，30 min)，重復(fù)洗滌過程2～3次，直至蛋白質(zhì)沉淀物為純白色，將沉淀真空冷凍成干粉，－80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 蛋白質(zhì)的裂解與定量 將蛋白質(zhì)干粉溶解于水化液(8 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，4%Chaps，65 mmol/L DTT，0.5%載體兩性電解質(zhì))，32℃水浴30 min，振蕩充分混勻后用液氮冷卻，此過程重復(fù)2次，于20℃下14 000 r/min離心15 min，吸取上清備用。蛋白質(zhì)濃度測定參考考馬斯亮藍(lán)Bradford法。

1.3.3 蛋白質(zhì)雙向電泳(2D-PAGE) 主要按IPG-phor等電聚焦系統(tǒng)指南進(jìn)行。取適量蛋白質(zhì)樣品與水化液(加入痕量0.001%溴酚藍(lán))充分混合至380 μl，沿 PROTAIN IEF Cell型電泳儀(BIO-RAD)聚焦槽內(nèi)連續(xù)加入，將17 cm IPG膠條膠面朝下覆蓋在樣品上，被動(dòng)吸收1 h后，加3 ml礦物油覆蓋膠條，置于IPG等電聚焦儀的電極板上，在20℃條件下主動(dòng)水化15 h使膠條充分吸脹，吸收樣品，然后以每根50μA的極限電流按表1程序進(jìn)行第1向等電聚焦電泳。等電聚焦結(jié)束后，膠條分別在平衡緩沖液Ⅰ(6 mol/L 尿素，2%SDS，0.375 mol/L Tris-HCl，20%甘油，使用時(shí)加2%DTT)和平衡緩沖液Ⅱ(6 mol/L 尿素，2%SDS，0.375 mol/L Tris-HCl，20% 甘油，使用時(shí)加2.5%碘乙酰胺)中平衡15 min。第2向SDS-PAGE用12%和13%分離膠。凝膠染色采用硝酸銀染色法，其過程依次是:超純水洗2次，每次2 min，固定液［10%冰乙酸(體積比)+40%無水乙醇(體積比)］固定2.5 h，超純水快速?zèng)_洗2次，敏化液［30%甲醇(體積比)+0.2%硫代硫酸鈉(質(zhì)量體積比)+6.8%乙酸鈉(質(zhì)量體積比)］中30 min，超純水水洗3次，每次5 min，硝酸銀［0.25%硝酸銀(質(zhì)量體積比)］染色20 min，快速漂洗2次，顯影液［2.5%無水碳酸鈉(質(zhì)量體積比)+0.04%甲醛(質(zhì)量體積比)］顯影后加終止液［10%冰醋酸(體積比)］終止反應(yīng)。

表1 等電聚焦電泳程序Table 1 Procedures of isoelectric focusing electrophoresis

1.3.4 圖譜掃描與分析 用 UMAX PowerLook 2100XL型光密度掃描儀透射掃描染色后的雙向電泳凝膠獲取圖像，分辨率設(shè)為600 dpi，在PDQuest 2DE 8.0.1分析軟件(美國 Bio-Rad公司)的輔助下，定義蛋白質(zhì)點(diǎn)的大小、強(qiáng)弱，檢測和統(tǒng)計(jì)蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)目。

1.3.5 統(tǒng)計(jì)分析 用Microsoft Office Excel 2010對(duì)3次重復(fù)的2-DE圖譜上蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 不同提取方法對(duì)蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜質(zhì)量的影響

分別用TCA丙酮沉淀法和酚提取法提取小麥籽?？偟鞍踪|(zhì)，用蛋白質(zhì)裂解液裂解蛋白質(zhì)，用考馬斯亮藍(lán) Bradford法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量，以17 cm、pH5～8 IPG膠條進(jìn)行雙向電泳分離，硝酸銀染色。結(jié)果(圖1)顯示，用酚提取法提取的蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜酸性端蛋白質(zhì)點(diǎn)較模糊，分辨率低，橫豎紋干擾嚴(yán)重，堿性端效果稍好，但是檢測到的蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)偏少;而TCA丙酮沉淀法提取的蛋白質(zhì)雙向電泳凝膠圖譜蛋白質(zhì)點(diǎn)分布均勻，蛋白質(zhì)點(diǎn)清晰且更豐富，凝膠背景干凈，橫豎條紋干擾少。用PDQuest軟件統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，在相同的參數(shù)條件下，酚提取法可分辨出約260個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)，TCA丙酮沉淀法則可檢測到約490個(gè)清晰的蛋白質(zhì)點(diǎn)，比酚提取法多230個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)。說明采用TCA丙酮沉淀法提取的小麥籽粒蛋白質(zhì)雙向電泳分離效果較好。

2.2 不同pH值IPG膠條對(duì)雙向電泳圖譜的影響

用等電點(diǎn)pH值4～7的IPG膠條進(jìn)行的籽粒蛋白質(zhì)電泳分離結(jié)果表明，蛋白質(zhì)大多集中在堿性端，pH 4～5范圍內(nèi)蛋白質(zhì)點(diǎn)很少;等電點(diǎn)pH 5～8 IPG膠條的電泳分離結(jié)果表明:蛋白質(zhì)點(diǎn)分布較均勻，能更好地滿足研究分析的需求(圖2)。

圖1 不同方法提取的蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜比較Fig.1 Comparison of 2-DE maps of proteins extracted by two methods

圖2 不同pH值IPG膠條的雙向電泳圖譜比較Fig.2 2-DE maps of protein in the systems with different p H ranges of IPG

2.3 上樣量及SDS-PAGE膠濃度對(duì)雙向電泳圖譜的影響

為了更好地分離蛋白質(zhì)，進(jìn)一步比較分析了雙向電泳中不同蛋白質(zhì)上樣量和SDS-PAGE膠濃度。選用17 cm、pH 5～8 IPG 膠條，分別取300μg、380 μg和450μg蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行雙向電泳，結(jié)果見圖3。在上樣量為300μg時(shí)，雙向電泳圖譜上蛋白質(zhì)點(diǎn)模糊不清，低豐度蛋白質(zhì)因不能被檢測而丟失，影響了雙向電泳的準(zhǔn)確性和重復(fù)性，經(jīng)軟件分析檢出304個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn);在上樣量為450μg時(shí)，蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)多，但高豐度蛋白質(zhì)點(diǎn)過大，出現(xiàn)飽和重疊現(xiàn)象，掩蓋了其他蛋白質(zhì)點(diǎn)，而且圖譜上橫條紋比較明顯，影響了蛋白質(zhì)點(diǎn)的分離與分析，經(jīng)軟件分析檢出570個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn);上樣量為380μg時(shí)，蛋白質(zhì)點(diǎn)清晰，無橫條紋干擾，聚焦效果好，圖譜質(zhì)量最佳，經(jīng)軟件分析檢出516個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)。

圖3 不同蛋白質(zhì)上樣量的雙向電泳圖譜比較Fig.3 2-DE maps of different loading quantities of proteins

在選用17 cm pH5～8膠條、上樣量380μg的基礎(chǔ)上，分別以12%和13%的SDS-PAGE膠濃度對(duì)小麥籽粒蛋白質(zhì)進(jìn)行電泳分析。分離膠濃度為13%時(shí)，高分子量蛋白質(zhì)分離不充分，蛋白質(zhì)擠壓疊加，遮蓋了某些蛋白質(zhì)點(diǎn)在圖譜上的表達(dá)，從而降低了分辨率;分離膠濃度為12%時(shí)，蛋白質(zhì)分離較好，蛋白質(zhì)點(diǎn)清晰圓潤，獲得較好的分離圖譜(圖4)。

圖4 不同分離膠濃度的雙向電泳圖譜比較Fig.4 2-DE maps of protein in the systems with different gel concentrations

2.4 雙向電泳圖譜的重復(fù)性分析

蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜的重復(fù)性，是后續(xù)蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果可靠性的基本保障。為分析本研究建立的小麥籽粒蛋白質(zhì)雙向電泳體系的重復(fù)性，在上述優(yōu)化條件的基礎(chǔ)上，采用嚴(yán)格一致的操作程序，并精確控制電泳溫度與電流電壓，進(jìn)行了3次雙向電泳重復(fù)試驗(yàn)。經(jīng)軟件分析發(fā)現(xiàn)，3張圖譜分別檢測到490、512、531個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)。選取其中1張凝膠圖譜作為參考膠，其余圖譜與其進(jìn)行蛋白質(zhì)點(diǎn)匹配分析，平均匹配率達(dá)到96%。蛋白質(zhì)點(diǎn)位置在IPGIEF方向偏移為 (1.79±0.36)mm，在 SDS-PAGE方向偏移為 (1.65±0.41)mm。說明所建立的雙向電泳體系重復(fù)性和穩(wěn)定性均較高。

3 討論

蛋白質(zhì)組學(xué)是后基因組時(shí)代生命科學(xué)研究的一個(gè)重要領(lǐng)域，蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要性使其相關(guān)技術(shù)得到突飛猛進(jìn)的發(fā)展［13］。其中，雙向電泳作為分離分析蛋白質(zhì)的重要手段，在蛋白質(zhì)組研究中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。因此，對(duì)雙向電泳條件進(jìn)行優(yōu)化顯得尤為重要。

樣品制備是雙向電泳的第一步，采用不同方法提取的蛋白質(zhì)電泳效果不同。增廣娟等［14］比較了蘋果葉片蛋白質(zhì)的不同提取方法，結(jié)果表明改良的Tris-HCl提取法的蛋白質(zhì)點(diǎn)最多，雙向電泳效果最好。陳蕊紅等［12］比較分析了不同小麥花藥蛋白質(zhì)提取方法，發(fā)現(xiàn)TCA丙酮法提取效果較好。石海波等［15］對(duì)玉米籽粒蛋白質(zhì)不同提取方法的研究結(jié)果表明，可溶性蛋白質(zhì)提取法獲得的蛋白質(zhì)純度高、濃度適中、雙向電泳蛋白質(zhì)點(diǎn)最豐富，最適合雙向電泳研究。李奇松等［16］對(duì)比了3種不同的蛋白質(zhì)提取方法，結(jié)果表明可溶性蛋白質(zhì)提取法最適用于籽粒蛋白質(zhì)組學(xué)的研究。本試驗(yàn)對(duì)比分析了用途較為廣泛的TCA丙酮沉淀法和酚提取法，結(jié)果表明TCA丙酮沉淀法比較適用于雙向電泳圖譜分析，這與王慧娜等［11］的研究結(jié)果有分歧，推測可能與提取過程中所用的試劑配方不同有關(guān)。

雙向電泳體系中電泳條件包括膠條pH值、上樣量和SDS-PAGE分離膠濃度等方面［17］。理想的IPG膠條，既要覆蓋樣品中全部蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，又不能因等電點(diǎn)相對(duì)集中導(dǎo)致大量蛋白質(zhì)點(diǎn)聚集在一起。本研究根據(jù)前期對(duì)小麥葉片蛋白質(zhì)雙向電泳分離試驗(yàn)的經(jīng)驗(yàn)，首先采用了等電點(diǎn)pH值4～7的IPG膠條對(duì)小麥籽粒蛋白質(zhì)進(jìn)行分離，發(fā)現(xiàn)大部分蛋白質(zhì)集中在堿性端，蛋白質(zhì)點(diǎn)之間緊密相連，甚至重疊在一起，模糊且不易區(qū)分，改用等電點(diǎn)pH 5～8的IPG膠條后，籽粒蛋白質(zhì)分辨率顯著提高，分離效果較好，檢測到的蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)多。

合適的上樣量和分離膠濃度在雙向電泳中是非常重要的。過大的上樣量和分離膠濃度，容易導(dǎo)致蛋白質(zhì)大量聚集，遮蓋部分蛋白質(zhì)點(diǎn)的表達(dá)，無法反映蛋白質(zhì)組的全部信息;上樣量和分離膠濃度過低會(huì)導(dǎo)致一些低分子量和低豐度蛋白質(zhì)超出凝膠所容納的范圍，不能在雙向電泳圖譜上顯現(xiàn)。上樣量的多少與IPG膠條的長度、pH值和蛋白質(zhì)染色方法密切相關(guān)。本研究在選用長度17 cm、pH5～8 IPG膠條，采用硝酸銀染色的基礎(chǔ)上借鑒以往的操作經(jīng)驗(yàn)，比較了不同上樣量(300 μg、380 μg、450 μg)的雙向電泳效果，結(jié)果表明蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)量隨上樣量的增加而增多，但是當(dāng)上樣量增加到450μg時(shí)，蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)量比上樣量380 μg時(shí)略有增多，但是蛋白質(zhì)點(diǎn)之間出現(xiàn)了互相重疊，相互干擾現(xiàn)象，表明380μg的上樣量較佳。在此基礎(chǔ)上比較了分離膠濃度12%和13%的SDS-PAGE凝膠電泳圖譜，發(fā)現(xiàn)12%的分離膠濃度能夠更有效地分離小麥籽粒蛋白質(zhì)。3次重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果表明，本研究建立的雙向電泳體系重復(fù)性較好。

綜上所述，應(yīng)用本研究建立的雙向電泳體系，能夠獲得重復(fù)性好、蛋白質(zhì)點(diǎn)清晰、數(shù)量豐富的雙向電泳圖譜，該體系適合于小麥籽粒全蛋白質(zhì)的雙向電泳分析。

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