金崇富， 陳長寬， 楊智青， 時(shí) 凱， 陳應(yīng)江

(江蘇沿海地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇 鹽城 224002)

胰島素樣生長因子(Insulin-like growth factor，IGF)是人體最重要的生長因子之一。IGF家族由2個(gè)多肽類生長因子(IGF1、IGF2)、2類受體(IGF1R、IGF2R)和7種結(jié)合蛋白(IGFBP1～I(xiàn)GFBP7)組成，它們是動(dòng)物生長軸上重要的因子，具有強(qiáng)烈的促生長和分化作用［1］。2類IGF受體的結(jié)構(gòu)和功能差異很大，其中第1類IGF受體(IGF1R)是IGF功能的主要介導(dǎo)者。Moe等［2］研究了IGF1R基因編碼區(qū)單核苷酸多態(tài)性與日本鵪鶉體質(zhì)量的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)不同基因型對10周齡體質(zhì)量有極顯著的影響。高鳳華等［3］對東北農(nóng)業(yè)大學(xué)肉雞品系的IGF1R基因進(jìn)行遺傳多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)不同基因型對5周齡體質(zhì)量有顯著影響。雷明明等［4］研究發(fā)現(xiàn)，C17337024G/T突變位點(diǎn)與生長和屠體性狀顯著相關(guān)，與初生質(zhì)量顯著相關(guān)。

IGFBP-3主要存在于血液中，它對IGF1和IGF2具有很高的親和力，是血液中最為豐富的IGFBP結(jié)合形式。血液中95%的IGF1和IGF2都與IGFBP-3結(jié)合，因此，IGFBP-3對于IGF作用的發(fā)揮起著重要作用［5］。另外，IGFBP-3可以增強(qiáng) IGF1的效應(yīng)，能促進(jìn)IGF1在骨骼上的合成代謝效應(yīng)。胡沈榮等［6］對西農(nóng)薩能奶山羊IGFBP-3基因進(jìn)行了遺傳多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)西農(nóng)薩能奶山羊IGFBP-3的Xsp-I基因座不同基因型間的第二胎產(chǎn)羔數(shù)有顯著差異，且初生質(zhì)量也存在顯著差異(P＜0.05)。劉哲等［7］對奶牛IGFBP-3基因進(jìn)行了多態(tài)性分析，分析結(jié)果表明AA型12月齡體長和體高均極顯著高于AB型。

數(shù)量性狀是由許多微效基因或稱多基因(Polygene)的聯(lián)合效應(yīng)控制的，數(shù)量性狀直接影響畜牧產(chǎn)品的產(chǎn)量及經(jīng)濟(jì)效益。如果僅僅從單基因入手進(jìn)行分子輔助育種，往往不能達(dá)到最終的育種目標(biāo)。在分析多基因調(diào)控的數(shù)量性狀時(shí)，需要同時(shí)對多個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行分析，這樣才能得到基因與性狀之間的真實(shí)相關(guān)性，在利用DNA標(biāo)記進(jìn)行輔助選擇時(shí)才可能獲得更大的遺傳進(jìn)展［8］。本研究以鹽城地方草雞為研究對象，對IGF1R、IGFBP-3基因進(jìn)行互作效應(yīng)分析，以期能較全面地研究鹽城地方草雞生產(chǎn)性狀的分子遺傳機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

從江蘇沿海地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所生態(tài)養(yǎng)殖基地采集210只母雞血樣，同時(shí)記錄母雞生長性狀(初生質(zhì)量及4、8、12、16周齡體質(zhì)量)和繁殖性狀(開產(chǎn)日齡、開產(chǎn)體質(zhì)量、開產(chǎn)蛋質(zhì)量、300日齡產(chǎn)蛋數(shù))。翅靜脈采集血樣1.5 ml，肝素鈉抗凝，－20℃保存。DNA提取試劑盒(Omega blood DNA kit)法提取基因組DNA。

1.2 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank中雞IGF1R基因(NC_006097)和IGFBP-3基因(NC_006089)序列，設(shè)計(jì)IGF1R基因第2外顯子引物IGR2-1和IGR2-2，以及IGFBP-3基因第1和2外顯子引物IBP1和IBP2(表1)。引物由上海生物工程有限公司合成。

表1 引物信息Table 1 The information of the primers

1.3 PCR-SSCP 分析

將3μl PCR產(chǎn)物加入7μl變性緩沖液中，98℃變性10 min，然后迅速冰浴5 min。將變性PCR產(chǎn)物點(diǎn)樣加入到10%聚丙烯酰胺凝膠中，140 V電壓電泳12 h。在電泳結(jié)束后，進(jìn)行銀染顯色并拍照記錄結(jié)果。

1.4 IGF1R、IGFBP-3 基因綜合標(biāo)記

兩基因位點(diǎn)間互作用以下模型進(jìn)行方差分析:yijk=μ + Gi+ Gj+ Gij+ eijk，式中，yijk為性狀測定值，μ 為群體平均值，Gi、Gj為基因型效應(yīng)，Gij為位點(diǎn)i和位點(diǎn)j間的互作效應(yīng)，e為隨機(jī)殘差效應(yīng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 IGF1R、IGFBP-3基因 SSCP引物的 PCR擴(kuò)增

采用 PCR-SSCP法分析 IGR2-1、IGR2-2和IBP1、IBP2引物擴(kuò)增片段。結(jié)果顯示:IGR2-1擴(kuò)增片段有3種帶型，定義為AA、AB和BB;IGR2-2擴(kuò)增片段有3種帶型，定義為CC、CD和DD;IBP1擴(kuò)增片段有3種帶型，定義為EE、EF和FF;IBP2擴(kuò)增片段有3種帶型，定義為GG、GH和HH(圖1)。

2.2 IGF1R、IGFBP-3基因序列分析結(jié)果

測序結(jié)果表明，引物IGR2-1的PCR產(chǎn)物片段的BB型與AA型相比在第26 333 bp處發(fā)生了G→A突變，引物IGR2-2的PCR產(chǎn)物片段的DD型與CC型相比在第26 336 bp處發(fā)生了G→A突變，引物IBP1的PCR產(chǎn)物片段的FF型與EE型相比在第160 bp處發(fā)生了T→G突變，引物IBP2-1的PCR產(chǎn)物片段的HH型與GG型相比在第1 087 bp處發(fā)生了C→T突變(圖2)。

圖1 引物IGR2-1(a)、IGR2-2(b)、IBP1(c)和IBP2(d)的SSCP分析結(jié)果Fig.1 SSCP analysis of PCR product using primers IGR2-1(a)，IGR2-2(b)，IBP1(c)and IBP2(d)

圖2 雞不同基因型PCR產(chǎn)物片段的序列比較Fig.2 Sequence alignment of PCR product segments of different genotypes in chickens

2.3 IGF1R、IGFBP-3基因群體遺傳學(xué)分析

G26333A位點(diǎn)AA基因型為優(yōu)勢基因型，基因型頻率為0.745;等位基因A為優(yōu)勢等位基因，等位基因頻率為0.855。G26336A位點(diǎn)CC基因型為優(yōu)勢基因型，基因型頻率為0.555;等位基因C為優(yōu)勢等位基因，等位基因頻率為0.755。T160G位點(diǎn)FF基因型為優(yōu)勢基因型，基因型頻率為0.495;等位基因F為優(yōu)勢等位基因，等位基因頻率為0.703。C1087T位點(diǎn)GG基因型為優(yōu)勢基因型，基因型頻率為0.415;等位基因G為優(yōu)勢等位基因，等位基因頻率為0.615(表2)。

卡方適合性檢驗(yàn)結(jié)果表明，群體除了在C1087T位點(diǎn)偏離Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)外(P＜0.05)，在其余位點(diǎn)都處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。

表2 IGF1R、IGFBP-3基因基因型和等位基因頻率Table 2 Genotype and allele frequency of IGF1R and IGFBP-3 genes

2.4 IGF1R基因 G26336位點(diǎn)和 IGFBP-3基因C1087T位點(diǎn)與生產(chǎn)性能的關(guān)聯(lián)分析

由表3可知，DD基因型個(gè)體在8周齡時(shí)體質(zhì)量顯著高于CC基因型(P＜0.05)，DD基因型個(gè)體在12周齡時(shí)體質(zhì)量顯著高于CC和CD基因型(P＜0.05)。由表4可知，GH基因型個(gè)體的開產(chǎn)日齡顯著低于HH基因型(P＜0.05)。

表3 G26336位點(diǎn)基因型與雞生產(chǎn)性能的相關(guān)性Table 3 Association of G26336 genotypes with production performance in chickens

表4 C1087T位點(diǎn)基因型與雞生產(chǎn)性能的相關(guān)性Table4 Association of C1087T genotypes with production performance in chickens

2.5 IGF1R基因和IGFBP-3基因?qū)Ψ敝承誀畹幕プ餍?yīng)

IGF1R基因與IGFBP-3基因?qū)Ψ敝承誀畹幕プ餍?yīng)見表 5。由表 5可知，G26333A×T160G、G26333A×C1087T、G26336A×T160G和G26336A×C1087T對開產(chǎn)日齡、開產(chǎn)體質(zhì)量、開產(chǎn)蛋質(zhì)量及300日齡產(chǎn)蛋數(shù)均無顯著影響(P＞0.05)。故IGF1R基因與IGFBP-3基因?qū)}城地方草雞的繁殖性狀不存在互作。

表5 IGF1R基因和IGFBP-3基因?qū)﹄u繁殖性狀的互作效應(yīng)Table 5 Interaction effect of IGF1R and IGFBP-3 genes on reproductive traits in chickens

2.6 IGF1R基因和IGFBP-3基因?qū)ιL性狀的互作效應(yīng)

IGF1R基因和IGFBP-3基因?qū)ιL性狀的互作效應(yīng)見表6。由表6可見，IGF1R基因和IGFBP-3基因?qū)}城地方草雞生長性狀存在一定互作，IGF1R基因G26336A位點(diǎn)與IGFBP-3基因C1087T位點(diǎn)對12周齡體質(zhì)量存在互作效應(yīng)。

2.7 IGF1R和IGFBP-3基因型組合對生產(chǎn)性狀的互作效應(yīng)分析

G26336A與C1087T位點(diǎn)基因型組合對生長性狀的互作效應(yīng)見表7。G26336A和C1087T位點(diǎn)共檢測到9種基因型組合。由于DD/HH個(gè)體數(shù)較少(1只)，不參與多重比較。CC/GG和CC/HH基因型組合個(gè)體的開產(chǎn)日齡極顯著高于CD/GH(P＜0.01)，CC/GH基因型組合個(gè)體的初生質(zhì)量顯著高于CD/GG(P＜0.05)，DD/GG基因型組合個(gè)體的8周齡體質(zhì)量顯著高于CC/HH(P＜0.05)，DD/GG基因型組合個(gè)體的12周齡體質(zhì)量極顯著高于CC/GG、CC/GH、CC/HH、CD/GG、CD/GH 和CD/HH(P ＜0.01)。

表6 IGF1R基因和IGFBP-3基因?qū)﹄u生長性狀的互作效應(yīng)Table 6 Interaction effect of IGF1R and IGFBP-3 genes on growth traits in chickens

表7 IGF1R基因G26336A位點(diǎn)和IGFBP-3基因C1087T位點(diǎn)不同基因型組合與雞生長性狀的相關(guān)性Table 7 The relationship between different genotype combinations of IGF1R and IGFBP-3 genes and growth traits in chickens

基因型組合后括號內(nèi)數(shù)值表示該基因型組合雞的只數(shù)。同列中不同大、小寫字母分別表示差異極顯著(P＜0.01)和差異顯著(P＜0.05)。

3 討論

在IGF1R基因G26336A位點(diǎn)上，DD基因型個(gè)體的8周齡體質(zhì)量顯著高于CC基因型個(gè)體(P＜0.05)，12周齡體質(zhì)量顯著高于CC和CD基因型個(gè)體(P＜0.05);從4、8、12周齡體質(zhì)量看，具有DD＞CD＞CC的趨勢;等位基因D是體質(zhì)量性狀的增效基因，等位基因C是體質(zhì)量性狀的減效基因。在IGFBP-3基因C1087T位點(diǎn)上，GH基因型個(gè)體的開產(chǎn)日齡顯著低于HH基因型(P＜0.05)。

培育具有綜合性能的優(yōu)良家禽品種已成為現(xiàn)代家禽育種的重要目標(biāo)。由于家禽許多經(jīng)濟(jì)性狀是多基因控制的數(shù)量性狀，在育種中通過分子標(biāo)記選擇含有多個(gè)目標(biāo)基因的個(gè)體，從中再選出優(yōu)良的個(gè)體，實(shí)現(xiàn)有利基因的聚合，使品種具有更優(yōu)良的生產(chǎn)性能。目前，通過分子標(biāo)記將多個(gè)影響家禽生產(chǎn)性狀的基因聚合在一起的研究報(bào)道不多。趙秀華［9］在京海黃雞群體中對IGFBP-1、IGFBP-2和STAT5基因進(jìn)行了三基因互作效應(yīng)分析，結(jié)果顯示三基因合并效應(yīng)＞兩基因合并效應(yīng)＞單基因效應(yīng)，而且組合基因型效應(yīng)不是單個(gè)基因型效應(yīng)的簡單相加，其效果要優(yōu)于單個(gè)基因型的效應(yīng)。李國輝等［10］以白耳雞為試驗(yàn)對象，檢測GH、POU1F1和PRL基因單核苷酸多態(tài)性，分析這3個(gè)基因的單基因效應(yīng)與聚合基因型效應(yīng)。生產(chǎn)上可通過選擇影響生產(chǎn)性狀的2個(gè)基因的SNP，進(jìn)行分子標(biāo)記輔助育種，這比用單個(gè)基因進(jìn)行選擇的風(fēng)險(xiǎn)小。多基因的基因型組合效應(yīng)不是單基因的基因型效應(yīng)的簡單相加，而是高于最好的單基因的基因型效應(yīng)。這提示我們，在分析多基因調(diào)控的數(shù)量性狀時(shí)，需要同時(shí)對多個(gè)位點(diǎn)組成的基因型組合進(jìn)行分析，這樣才能得到基因與性狀之間的真實(shí)相關(guān)性。

本研究IGF1R基因G26336A位點(diǎn)與IGFBP-3基因C1087T位點(diǎn)基因型組合中，CC/GG和CC/HH個(gè)體開產(chǎn)日齡最大;CC/GH個(gè)體初生質(zhì)量最大;DD/GG個(gè)體8周齡體質(zhì)量最大;DD/GG個(gè)體12周齡體質(zhì)量最大，均值為 (1 072.60±53.15)g，極顯著地高于其他基因型組合個(gè)體。提示G26336A×C1087T基因型組合中剔除CC/GG和CC/HH型個(gè)體可減小開產(chǎn)日齡，選留CC/GH型個(gè)體可提高初生質(zhì)量，選留DD/GG型個(gè)體可提高8周齡和12周齡體質(zhì)量。

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