陳 哲， 雷明明， 于建寧， 王公金， 施振旦

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所，動物品種改良與繁育重點實驗室，江蘇 南京 210014)

抵抗素樣 β(Resistin-like molecule β，RELMβ)是抵抗素樣家族(Resistin-like molecules，RELMs)一員，RELMs共有 4個成員，分別是 RELMα、RELMβ、resistin和RELMγ，該家族成員在C端信號區(qū)內(nèi)含有獨特的10到11個半保守的半胱氨酸殘基，可通過二硫鍵形成低聚分子［1］。RELMs在糖尿病、炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)和細(xì)胞增殖方面都有相關(guān)作用［2］。RELMβ又稱發(fā)現(xiàn)于炎癥帶2(Found in inflammatory zone 2，F(xiàn)IZZ2)，最初是在嚙齒類和人類的胃腸道發(fā)現(xiàn)，在近端和遠(yuǎn)端結(jié)腸表達量最為豐富［3］。

研究發(fā)現(xiàn)，RELMβ可由腸道杯狀細(xì)胞產(chǎn)生，并作為Th2細(xì)胞因子誘導(dǎo)的免疫效應(yīng)因子，參與胃腸道感染的耐受［4］。RELMβ可以通過依賴 IL-4(Interleukin 4)和IL-13的調(diào)控途徑產(chǎn)生抗寄生蟲作用［5］，同時還可直接與寄生蟲的化學(xué)感受部位結(jié)合，干擾寄生蟲營養(yǎng)供給，起到蠕蟲抑制劑的作用［6］。此外，RELMβ還可以通過上調(diào)腸道先天免疫因子MUC2的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達水平，保護腸道粘膜屏障的完整性［7］。RELMβ作為一個免疫相關(guān)的重要候選基因，對畜禽健康具有重要意義。

目前對RELMβ的功能有了較為廣泛的研究，但其表達調(diào)控機制尚不十分清晰。本研究利用熒光素酶報告基因系統(tǒng)，對豬RELMβ基因啟動子進行結(jié)構(gòu)和活性分析，找到RELMβ基因啟動子的核心調(diào)控區(qū)域，為進一步研究豬RELMβ基因表達調(diào)控機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

Premix Taq 酶、T4 DNA 連接酶、DNA marker、內(nèi)切酶、瓊脂糖回收純化試劑盒、小提質(zhì)粒提取試劑盒、中提質(zhì)粒提取試劑盒購自寶生物(大連)有限公司，克隆所用菌株DH5α為本實驗室保存，pGL3-basic、pGL3-Enhancer、pRL-Tk 載體和雙熒光素酶檢測試劑盒購自Promega公司，人胚腎細(xì)胞株293T、人結(jié)腸腺癌細(xì)胞株HT29購自凱基生物(南京)，Lipo LTX、Opti-MEM、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自Invitrogen公司，引物合成及DNA測序由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司完成。

1.2 試驗方法

1.2.1 生物信息學(xué)分析 使用 GPMiner(http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html)預(yù) 測RELMβ基因 5'端轉(zhuǎn)錄起始位點 TSS;使用 TFSEARCH 在線軟件(http://mbs.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html)和 Genomatix MatInspector(http://www.genomatrix.de/cqi-bin)對潛在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點進行預(yù)測;使用NCBI網(wǎng)站Blast(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)序列分析軟件對豬、人(NCBI登錄號:NT_005612)和小鼠(NCBI登錄號:NT_039624)啟動子序列進行多重比對，比較同源性;使用Primer6.0軟件里的Motif模塊進行TATA-box(識別序列TATAWAW，W代表A或T)、CAAT-box(識別序列 CCAAT)和 GC-box(識別序列GGGCGG)位點預(yù)測。

1.2.2 引物設(shè)計和PCR 根據(jù)GenBank獲得的人RELMβ基因(登錄號:NT_005612)序列以及豬RELMβ基因mRNA序列(登錄號:NM_001103210)，結(jié)合引物設(shè)計原則，采用Primer 6.0軟件自行設(shè)計6對PCR引物序列(表1)，并在上下游引物引入NheⅠ和XhoⅠ酶切位點。在0.2 ml PCR反應(yīng)管中加入 Premix Taq 12.5 μl，DNA 模板1 μl，上下游引物各1μl，無菌去離子水9.5μl。PCR反應(yīng)條件:98℃預(yù)變性3 min;98℃變性30 s，退火30 s，72℃延伸1 min，循環(huán)36次，最后產(chǎn)物在72℃延伸10 min。

表1 擴增RELMβ基因啟動子片段引物Table 1 Primers designed for amplifying promoter segments of porcine RELMβgene

1.2.3 報告基因載體構(gòu)建 將PCR反應(yīng)獲得的不同長度啟動子片段純化，經(jīng)NheⅠ和XhoⅠ雙酶切、凝膠回收、T4 DNA連接酶連接后，定向克隆到報告基因載體pGL3-Enhancer中，利用NheⅠ和XhoⅠ雙酶切和測序方法，篩選構(gòu)建正確的重組豬RELMβ基因啟動子熒光素酶報告質(zhì)粒。

1.2.4 細(xì)胞培養(yǎng)和瞬時轉(zhuǎn)染試驗 用含有10%胎牛血清、青霉素(100 U/ml)和鏈霉素(100 U/ml)的DMEM培養(yǎng)基，37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)胚腎293T細(xì)胞、人結(jié)腸腺癌細(xì)胞 HT29，0.25%胰酶消化液消化傳代，每2 d傳代1次。

接種293T、HT29細(xì)胞于96孔板，當(dāng)細(xì)胞生長至匯合率 70%～80%時，將構(gòu)建的pGLRELMβ-Enhancer系列缺失片段熒光素酶報告載體采用脂質(zhì)體Lipo LTX轉(zhuǎn)染到以上細(xì)胞內(nèi)，作為試驗組，同時轉(zhuǎn)染 pGL3-basic為陰性對照組，pRL-TK為內(nèi)參質(zhì)粒，試驗重復(fù)3次，每組3個平行試驗?；蛩矔r轉(zhuǎn)染參照Lipofectamine LTX試劑盒說明書進行。

1.2.5 雙熒光素酶活性分析 轉(zhuǎn)染24 h后，收集細(xì)胞，加入30μl細(xì)胞裂解緩沖液，室溫?fù)u晃15 min后，吹打細(xì)胞，收集裂解液至96孔白板，加入100μl熒光素酶分析劑(LARⅡ)，放置發(fā)光檢測儀Glomax(Promega)中，測定Firefly熒光素酶活性(M1)，然后再加入100μl Stop＆Glo reagent，測定內(nèi)參質(zhì)粒中Renilla熒光素酶活性(M2)，計算熒光素酶相對活性(M1/M2)。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 不同缺失片段啟動子活性值之間的比較在Excel中進行，統(tǒng)計方法使用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 豬RELMβ基因啟動子系列缺失片段的擴增

通過PCR分別得到1 057 bp(－842～+215)、1 008 bp(－793～ +215)、789 bp(－574～ +215)、397 bp(－182～ +215)、362 bp(－147～ +215)和301 bp(－86～+215)的啟動子片段。PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測顯示擴增長度符合預(yù)期，重組報告載體經(jīng)過NheⅠ和XhoⅠ雙酶切和DNA測序驗證，不同長度RELMβ啟動子報告基因載體構(gòu)建成功(圖1)。

2.2 豬RELMβ基因啟動子序列生物信息學(xué)分析

圖1 重組RELMβ基因報告載體雙酶切鑒定Fig.1 Identification of recombinant RELMβ gene report plasmid by double enzyme digestion

對豬RELMβ基因5'端序列進行在線生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，豬RELMβ基因啟動子區(qū)存在1處TATA box，1 處 CAAT box，無 GC box。GPMiner在線分析預(yù)測豬和人RELMβ基因轉(zhuǎn)錄起始位點在－556 bp和－487 bp處。截取豬、人(NCBI登錄號:NT_005612)、小鼠(NCBI登錄號:NT_039624)的RELMβ基因起始密碼子前842 bp啟動子序列進行多重比對發(fā)現(xiàn)，豬和人的同源性是34.9%，豬和小鼠的同源性是82.4%。

盡管豬和人之間RELMβ基因啟動子序列保守性較低，結(jié)合TFSEARCH和Genomatix MatInspector預(yù)測豬RELMβ基因啟動子轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，比較發(fā)現(xiàn)，豬和人RELMβ基因啟動子區(qū)還是存在許多保守的潛在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，包括 Cdx2，SRY，NFKB，NKX-2，c-Myb，GATA-1，GATA-3，C/EBP，MZF等(圖2)。

2.3 豬RELMβ基因啟動子活性分析

將構(gòu)建的 pGL-RELMβ(－842～ +215)、pGLRELMβ(－793～ +215)、pGL-RELMβ (－574～+215)、pGL-RELMβ(－182～ +215)、pGL-RELMβ(－147～+215)和 pGL-RELMβ(－86～ +215)啟動子報告載體分別轉(zhuǎn)染至HT29和293T細(xì)胞，雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果表明:不同長度RELMβ啟動子在HT29和293T細(xì)胞均具有活性，且在2個細(xì)胞系中，pGL-RELMβ(－574～+215)活性均為最強，顯著高于其他報告質(zhì)粒的活性(P＜0.01)。從pGL-RELMβ (－574～ +215)到 pGL-RELMβ(－182～+215)的相對熒光值下降幅度最大，推測在－574～－182位點存在RELMβ基因啟動子的關(guān)鍵順式調(diào)控元件(圖3)。

圖2 豬和人RELMβ基因啟動子序列比較分析Fig.2 Alignment of RELMβ gene promoter sequence of swine and human

圖3 RELMβ基因啟動子不同片段在細(xì)胞系內(nèi)的相對熒光素酶活性Fig.3 Activities of different segments of RELMβ promoter in HT29 and 293T cells

3 討論

腸道是能量攝取和營養(yǎng)吸收器官，也是重要的內(nèi)分泌器官，RELMβ參與腸道內(nèi)葡萄糖轉(zhuǎn)運、胰島素抵抗等生理功能。RELMβ通過GLUT2表達量和活性的增強提高空腸內(nèi)葡萄糖的吸收［8］;小鼠試驗發(fā)現(xiàn)RELMβ基因可能是營養(yǎng)因素誘導(dǎo)的胰島素抵抗行為的重要調(diào)節(jié)因子［9］，進一步的研究結(jié)果表明，RELMβ可能通過P38/MAPK途徑參與胰島素信號通路［10］。目前RELMβ已成為研究腸道疾患和評估肥胖型胰島素抵抗的新靶標(biāo)［10-11］。

為探討RELMβ基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制，本研究通過PCR方法從豬DNA獲得RELMβ基因上游－842～+215 bp的啟動子序列，進而構(gòu)建了不同長度的RELMβ啟動子重組報告質(zhì)粒，發(fā)現(xiàn)－574～+215 bp活性最強，在－574～－182 bp區(qū)域存在RELMβ基因啟動子的關(guān)鍵順式調(diào)控元件，TFSEARCH和Genomatix Mat Inspector軟件分析這一區(qū)域(匹配率參數(shù)分別設(shè)為90和0.9)，發(fā)現(xiàn) SRY、Cdx2、GATA-1 和 MZF1 匹配率較高。性別決定轉(zhuǎn)錄因子(SRY)是一類含有HMG-box DNA結(jié)合區(qū)的轉(zhuǎn)錄因子，在睪丸特異性表達，在腸道組織的表達還未發(fā)現(xiàn)，因此本研究得到的SRY結(jié)合位點可能是同樣含有HMG-box DNA結(jié)合區(qū)的類SRY基因，又稱SOX基因，Rath等研究SMP30基因(在肝細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞特異性表達)啟動子區(qū)活性也發(fā)現(xiàn)相似的現(xiàn)象［12］。SOX基因是一類與發(fā)育相關(guān)的基因，部分SOX基因(如SOX17)可以通過Wnt信號通路抑制與結(jié)腸癌細(xì)胞的生長與分裂有關(guān)的靶基因表達［13］。尾型同源盒轉(zhuǎn)錄因子2(Cdx2)僅在成體腸道中表達，是腸特異性轉(zhuǎn)錄因子，在腸上皮發(fā)育以及腸表型分化和維持中起到重要作用［14］，研究還發(fā)現(xiàn)，Cdx2可以特異性結(jié)合于黏液蛋白因子MUC2的啟動子，提高MUC2的表達水平［15］。鄭麗端等在人RELMβ基因啟動子區(qū)發(fā)現(xiàn)核心調(diào)控元件Cdx2能顯著增強啟動子活性［11］，進一步證明Cdx2在調(diào)控哺乳動物RELMβ基因啟動子活性中起到重要作用。髓樣鋅指蛋白1(MZF-1)通過調(diào)節(jié)蛋白激酶C-alpha的轉(zhuǎn)錄活性參與細(xì)胞的增殖、分化、轉(zhuǎn)化和凋亡［16］，Chelbi等研究發(fā)現(xiàn)MZF-1是SERPINA3基因啟動子轉(zhuǎn)錄激活過程不可缺少的轉(zhuǎn)錄因子，MZF-1結(jié)合在SERPINA3基因啟動子區(qū)結(jié)合位點可以激活其抗菌防御作用［17］。GATA家族是一類含鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，在胚胎發(fā)育時期能促進胃腸道的正常發(fā)育，并有助于在成年腸上皮細(xì)胞的不斷更新中調(diào)節(jié)組織分化，在體內(nèi)，GATA-1和c-Myb的相互作用會抑制GATA-1與DNA的結(jié)合，轉(zhuǎn)錄因子GATA-1和c-Myb相互抑制各自的轉(zhuǎn)錄活性［18］，本研究中豬RELMβ基因啟動子區(qū)包含GATA-1和c-Myb結(jié)合位點，說明GATA-1和c-Myb很有可能參與了RELMβ基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。

豬和人RELMβ基因啟動子區(qū)都存在CdxA，SRY，NFKB，NKX-2，c-Myb，GATA-1，GATA-3，C/EBP，MZF1等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，說明抵抗素樣家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式在進化上有保守性。下一步工作將通過定點突變和缺失等方法進一步探究RELMβ基因的核心啟動子及其轉(zhuǎn)錄活性受哪些轉(zhuǎn)錄因子影響。

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