錢 瑾

(海門市中醫(yī)院 藥劑科，江蘇 海門 226100)

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養(yǎng)血調(diào)經(jīng)合劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

錢 瑾

(海門市中醫(yī)院 藥劑科，江蘇 海門 226100)

目的：建立養(yǎng)血調(diào)經(jīng)合劑的質(zhì)量控制方法。方法：采用薄層色譜法對(duì)養(yǎng)血調(diào)經(jīng)合劑中川牛膝、陳皮、延胡索進(jìn)行定性鑒別，采用高效液相色譜法測(cè)定制劑中丹酚酸B的含量。結(jié)果：供試品溶液薄層色譜中川牛膝、陳皮、延胡索在與對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)；丹酚酸B在0.101 7～1.01 7μg進(jìn)樣量范圍內(nèi)與其峰面積積分呈良好的線性關(guān)系(r=1.0)；丹酚酸B平均回收率為98.20%，RSD=0.68%。結(jié)論：該方法準(zhǔn)確可靠,專屬性強(qiáng)，重現(xiàn)性好，可有效控制養(yǎng)血調(diào)經(jīng)合劑的質(zhì)量。

養(yǎng)血調(diào)經(jīng)合劑；薄層色譜法；丹酚酸B；高效液相色譜法

養(yǎng)血調(diào)經(jīng)合劑是根據(jù)我院名老中醫(yī)的經(jīng)驗(yàn)方研制而成的醫(yī)院制劑，由丹參、川牛膝、延胡索、制香附、熟地黃、陳皮等16味中藥組成，具有理氣活血、調(diào)經(jīng)止痛的功效，用于痛經(jīng)、閉經(jīng)、月經(jīng)不調(diào)等證的治療。由于該制劑屬于醫(yī)院制劑，藥典中并未收錄其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，因此本實(shí)驗(yàn)擬采用薄層色譜法對(duì)養(yǎng)血調(diào)經(jīng)合劑中的川牛膝、陳皮、延胡索進(jìn)行定性鑒別，同時(shí)采用高效液相色譜法測(cè)定制劑中主要有效成分丹酚酸B的含量，為養(yǎng)血調(diào)經(jīng)合劑的質(zhì)量控制提供參考[1-2]。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

薄層自動(dòng)成像儀(CAMAG TLC VISUALIZER)；BS110S萬(wàn)分之一天平(賽多利斯)；KQ-250B型超聲波清洗器(昆山超聲電子有限公司)；Agilent1260高效液相色譜儀；Agilent-G1329真空脫氣器；Agilent-G1315D 二極管陣列檢測(cè)器；CHEMSTATION B.04.02化學(xué)工作站；Agilent-G1311C四元泵。

1.2 試藥

川牛膝對(duì)照藥材(121065-201004)、陳皮對(duì)照藥材(120969-200808)、橙皮苷對(duì)照品(110721-200613)、延胡索對(duì)照藥材(120928-201006)、延胡索乙素對(duì)照品(110726-201011)、丹酚酸B對(duì)照品(111562-201009)均購(gòu)自于中國(guó)食品藥品檢定研究院。養(yǎng)血調(diào)經(jīng)合劑(批號(hào)141104、150113、150127)及陰性對(duì)照品均由海門市中醫(yī)院提供。乙腈、甲醇為色譜純，水為重蒸餾水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜定性鑒別

2.1.1 川牛膝的鑒別 取養(yǎng)血調(diào)經(jīng)合劑40mL，用無(wú)水乙醚振搖提取2次，每次40mL，合并乙醚提取液，水浴蒸干，殘?jiān)?mL乙酸乙酯溶解，即得供試品溶液。另取川牛膝對(duì)照藥材1g，加水50mL，煎煮30min后濾過，濾液濃縮至40mL，水浴蒸干，殘?jiān)?mL乙酸乙酯溶解，即得川牛膝對(duì)照藥材溶液。按照養(yǎng)血調(diào)經(jīng)合劑中藥材比例同法制備不含川牛膝的陰性對(duì)照溶液。參照2010年版《中國(guó)藥典》一部附錄Ⅵ B中的薄層色譜法，分別吸取上述三種溶液各8μL，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(10∶1∶0.5)作為展開劑，預(yù)飽和20min后展開，取出并晾干，再噴以10%硫酸乙醇溶液進(jìn)行顯色，置于105℃烘箱中加熱數(shù)分鐘，取出后于365nm波長(zhǎng)紫外光燈下檢視[3]。供試品溶液在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)位置有相同顏色熒光斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾，見圖1。

圖1 養(yǎng)血調(diào)經(jīng)合劑薄層色譜

注：1～3：養(yǎng)血調(diào)經(jīng)合劑(批號(hào)141104、150113、150127)；4：陰性對(duì)照；5：川牛膝對(duì)照藥材

2.1.2 陳皮的鑒別 取養(yǎng)血調(diào)經(jīng)合劑40mL，用乙酸乙酯振搖提取3次，每次30mL，合并乙酸乙酯提取液，水浴蒸干，殘?jiān)?mL甲醇溶解，即得供試品溶液。另取陳皮對(duì)照藥材1g，加水50mL，煎煮30min后濾過，濾液濃縮至40mL，水浴蒸干，殘?jiān)?mL甲醇溶解，即得陳皮對(duì)照藥材溶液。精密稱取橙皮苷對(duì)照品適量，加甲醇制備成飽和溶液，即得橙皮苷對(duì)照品溶液。按照養(yǎng)血調(diào)經(jīng)合劑中藥材比例同法制備不含陳皮的陰性對(duì)照溶液。參照2010年版《中國(guó)藥典》一部附錄Ⅵ B中的薄層色譜法，分別吸取上述四種溶液各6μL，點(diǎn)于同一塊硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲醇-水(100∶17∶13)作為展開劑，預(yù)飽和20min后展開，展開距離為5cm，再以甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水(20∶10∶1∶1)作為展開劑，預(yù)飽和20min后展開，展開距離為8cm，取出并晾干，噴以三氯化鋁試液進(jìn)行顯色，吹干后并于365nm波長(zhǎng)紫外光燈下檢視[3]。供試品溶液與對(duì)照藥材色譜和橙皮苷對(duì)照品色譜相應(yīng)位置有相同顏色熒光斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾，見圖2。

圖2 養(yǎng)血調(diào)經(jīng)合劑薄層色譜

注：1～3：養(yǎng)血調(diào)經(jīng)合劑(批號(hào)141104、150113、150127)；4：陰性對(duì)照；5：陳皮對(duì)照藥材；6：橙皮苷對(duì)照品

2.1.3 延胡索的鑒別 取養(yǎng)血調(diào)經(jīng)合劑40mL，加適量濃氨水調(diào)節(jié)pH至堿性，再用無(wú)水乙醚振搖萃取2次，每次40mL，合并乙醚液，水浴蒸干，殘?jiān)?mL甲醇溶解，即得供試品溶液。另取延胡索對(duì)照藥材1g，加水50mL，煎煮30min后過濾，濾液濃縮至40mL，水浴蒸干，殘?jiān)?mL甲醇溶解，即得延胡索對(duì)照藥材溶液。取延胡索乙素對(duì)照品適量，加甲醇配制成每1mL含1mg延胡索乙素的對(duì)照品溶液。按照養(yǎng)血調(diào)經(jīng)合劑中藥材比例同法制備不含延胡索的陰性對(duì)照溶液。參照2010年版《中國(guó)藥典》一部附錄Ⅵ B薄層色譜法，分別吸取上述四種溶液各6μL，點(diǎn)于同一塊硅膠G薄層板上，以甲苯-丙酮(9∶2)作為展開劑，預(yù)飽和20min后展開，取出并晾干，再置于碘缸中3min后取出，待薄層板上吸附的碘揮盡，于365nm波長(zhǎng)紫外光燈下檢視[3]。供試品溶液與對(duì)照藥材和延胡索乙素對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上有相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾，見圖3。

2.2 HPLC含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠(ODS)柱(250mm×4.6mm)；流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸溶液(22∶78)；梯度洗脫，流速：1mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：283nm；柱溫：30℃[3]。分別精密吸取養(yǎng)血調(diào)經(jīng)合劑溶液、丹酚酸對(duì)照品溶液各10μL注入高效液相色譜儀，結(jié)果顯示丹酚酸B與其他組分分離度良好，其中主峰與最近的雜質(zhì)峰的分離度大于1.50，理論板數(shù)均≥5 000。

圖3 養(yǎng)血調(diào)經(jīng)合劑薄層色譜

注：1～3：養(yǎng)血調(diào)經(jīng)合劑(批號(hào)141104、150113、150127)；4：陰性對(duì)照；5：延胡索對(duì)照藥材；6：延胡索乙素對(duì)照品

2.2.2 供試品溶液制備 精密量取養(yǎng)血調(diào)經(jīng)合劑5mL于50mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 對(duì)照品溶液制備 精密稱取丹酚酸B對(duì)照品適量，加50%甲醇溶液配制成每1mL含0.1mg丹酚酸B的溶液，搖勻，即得。

2.2.4 陰性對(duì)照溶液制備 按照養(yǎng)血調(diào)經(jīng)合劑中藥材比例同法制備不含丹參藥材的陰性對(duì)照品溶液。

2.2.5 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 取供試品溶液10μL，注入高效液相色譜儀，測(cè)得樣品中丹酚酸B的理論板數(shù)為14 178，丹酚酸B色譜峰與相鄰色譜峰之間的分離度大于1.50。

2.2.6 專屬性試驗(yàn) 分別精密量取丹酚酸B對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各10μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果表明，陰性對(duì)照樣品在與丹酚酸B對(duì)照品相同保留時(shí)間處無(wú)色譜峰干擾。

2.2.7 精密度試驗(yàn) 精密吸取丹酚酸B對(duì)照品溶液(0.101 7mg/mL)5μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，RSD為0.30%，表明儀器精密度良好。

2.2.8 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍考察 分別精密吸取丹酚酸B對(duì)照品溶液(0.101 7mg/mL)1、2、4、6、8、10μL，注入高效液相色譜儀，測(cè)定峰面積。以峰面積積分值作為縱坐標(biāo)Y，丹酚酸B進(jìn)樣量(μg)作為橫坐標(biāo)X，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得回歸方程：Y=733.399 7X-0.720 0，R=1.0。

2.2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別于0、2、4、12、24、48h取丹酚酸B對(duì)照品溶液(0.101 7mg/mL)10μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積，結(jié)果表明：丹酚酸B峰面積積分RSD為0.25%，表明丹酚酸B在48h內(nèi)性質(zhì)穩(wěn)定。

2.2.10 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取已知丹酚酸含量的養(yǎng)血調(diào)經(jīng)合劑(批號(hào)150127，0.535mg/ml)2.5mL，置于50mL容量瓶中，共6份，分別精密加入一定量丹酚酸B對(duì)照品溶液，按照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別進(jìn)樣10μL，求得平均回收率為98.20%，RSD=0.68%，符合藥典要求，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

2.2.11 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)(150127)樣品6份，按照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定供試品溶液中丹酚酸B含量，計(jì)算平均含量、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果表明該實(shí)驗(yàn)重復(fù)性良好。見表2。

表2 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.2.12 樣品含量測(cè)定 按照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件，測(cè)定3批不同樣品中丹酚酸B的含量，平均含量為0.60mg/mL，結(jié)果見表3。在平均含量的基礎(chǔ)上上下浮動(dòng)30%，暫定每1mL養(yǎng)血調(diào)經(jīng)合劑中含丹酚酸B不得少于0.40mg。

表3 不同批次樣品丹酚酸B含量測(cè)定結(jié)果 (mg/mL)

3 討論

養(yǎng)血調(diào)經(jīng)合劑是由多味中藥飲片經(jīng)現(xiàn)代工藝加工制成的醫(yī)院制劑，對(duì)痛經(jīng)、閉經(jīng)、月經(jīng)不調(diào)患者具有良好的治療效果。本研究在原有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，增加了川牛膝、陳皮和延胡索的薄層鑒別以及丹酚酸B的含量測(cè)定。丹參作為君藥之一，很有必要對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行控制。根據(jù)《江蘇省醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑標(biāo)準(zhǔn)提高工作方案》的要求，同時(shí)參照中國(guó)藥典2010年版第二增補(bǔ)本“丹參”項(xiàng)下的含量測(cè)定方法，以丹參酸B為對(duì)照品，采用高效液相色譜法測(cè)定養(yǎng)血調(diào)經(jīng)合劑中丹酚酸B的含量。在供試品溶液的制備過程中，對(duì)養(yǎng)血調(diào)經(jīng)合劑中丹酚酸B的提取溶劑進(jìn)行了比較和選擇，分別采用水、50%甲醇、70%甲醇以及甲醇作為提取溶劑。結(jié)果顯示，采用水作為提取溶劑時(shí)丹酚酸B的含量最高，因此確定水作為提取溶劑[4-5]。

本實(shí)驗(yàn)采用TLC法對(duì)方中川牛膝、陳皮、延胡索進(jìn)行定性鑒別，采用高效液相色譜法測(cè)定制劑中丹酚酸B的含量。該方法準(zhǔn)確可靠、專屬性強(qiáng)，重現(xiàn)性好，能有效控制養(yǎng)血調(diào)經(jīng)合劑的質(zhì)量。

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[2] 盧佶,吳君.高效液相色譜法測(cè)定養(yǎng)血調(diào)經(jīng)膠囊中芍藥苷的含量[J].海峽藥學(xué), 2012,24(10):83-84.

[3] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典[M].一部.北京:人民衛(wèi)生出版社,2010.

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(責(zé)任編輯：尹晨茹)

2015-07-29

錢瑾(1972-)，女，江蘇省海門市中醫(yī)院主管中藥師，研究方向?yàn)橹兴帉W(xué)。

R284.1

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1673-2197(2015)24-0044-03

10.11954/ytctyy.201524018