張蕾,黃榮凱,胡喜貴,于永昂

（1.河南科技學院,河南新鄉(xiāng)453003；2.西北農林科技大學,陜西楊凌712100）

釀酒酵母培養(yǎng)基的優(yōu)化

張蕾1,黃榮凱1,胡喜貴1,于永昂2

（1.河南科技學院,河南新鄉(xiāng)453003；2.西北農林科技大學,陜西楊凌712100）

為了提高釀酒酵母的生物量,采用單因素試驗和正交試驗設計相結合的方法,對釀酒酵母的培養(yǎng)基成分進行了優(yōu)化.結果表明：優(yōu)化后的配方為每100 mL培養(yǎng)基含蔗糖4 g,蛋白胨3 g,磷酸二氫鉀0.1 g,氯化鈉0.1 g.用此培養(yǎng)基進行發(fā)酵,釀酒酵母的生物量為17.5 g/L,比培養(yǎng)基優(yōu)化前的12.78 g/L提高了36.9%,OD560值為1.611,比培養(yǎng)基優(yōu)化前提高了36.2%.

釀酒酵母；正交試驗；培養(yǎng)基；優(yōu)化

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）作為人類利用最早的微生物,其營養(yǎng)成分十分豐富[1].釀酒酵母與同為真核生物的動物和植物細胞具有很多相同的結構,又容易培養(yǎng),因此被選為標準模型微生物系統(tǒng)[2-4].不管酵母菌是應用于釀酒還是醫(yī)藥等其他領域,獲得最大數量的菌體都是酵母菌應用的前提和基礎,研究和優(yōu)化菌體的生產條件,對于酵母菌產品的低成本應用具有重要意義.

近幾年來,人們利用以發(fā)酵獲得高細胞濃度的酵母為基礎生產大量的重組蛋白及生物制品,并取得一定的進展[5-6].這些研究成果都是在提高釀酒酵母生物量的基礎上取得的.影響釀酒酵母高細胞濃度發(fā)酵的因素非常多,如細胞所需要的營養(yǎng)物質、發(fā)酵過程中生長抑制物的積累、培養(yǎng)溫度、發(fā)酵液的pH值及發(fā)酵液流變學特性等.酵母發(fā)酵常用的碳源有葡萄糖、蔗糖、淀粉、果糖、麥芽糖等,常用的氮源有蛋白胨、酵母浸粉、尿素、硫酸銨、硝酸鉀等,而無機鹽、生長因子、微量元素等也是酵母生長必不可少的物質[7].不同的酵母菌株其生物學特性不完全相同,因此,本試驗針對啤酒車間保存的菌株,通過單因素比較試驗和正交試驗,篩選釀酒酵母培養(yǎng)基的優(yōu)化組合,為進一步擴大培養(yǎng)提供理論依據,奠定實踐基礎[8].

1 材料與方法

1.1 材料

釀酒酵母（河南科技學院生命科技學院啤酒中試車間保存）.

1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基（100 mL）：葡萄糖2 g,蛋白胨2 g,酵母浸粉1 g,瓊脂1.5 g,自然pH值.

種子培養(yǎng)基（100 mL）：葡萄糖2 g,蛋白胨2 g,酵母浸粉1 g,自然pH值.

發(fā)酵培養(yǎng)基（100 mL）：葡萄糖2 g,蛋白胨2 g,KH2PO40.1 g,MgSO4·7H2O 0.05 g,NaCl 0.05 g,pH 7.0～7.2.

1.3 方法

1.3.1 菌種活化和擴大培養(yǎng) 先制備斜面培養(yǎng)基,在無菌條件下,在斜面培養(yǎng)基接1環(huán)保藏菌種至恒溫培養(yǎng)箱30℃培養(yǎng)48 h復蘇菌種.菌種的擴大培養(yǎng)是用接種環(huán)取1環(huán)活化后的斜面菌種轉接到裝液量為20 mL/100mL的種子培養(yǎng)基中,在30℃、180 r/min條件下培養(yǎng)48 h.

1.3.2 菌體密度的測定 發(fā)酵液經過適當稀釋后用紫外可見分光光度計,以不接菌液的空白培養(yǎng)基作為對照,測量波長在560 nm處的OD值.

1.3.3 菌體生物量的測定 使用離心機使發(fā)酵液在5 000 r/min條件下離心15 min,用蒸餾水洗滌2次后收集菌體,置于烘干箱內105℃烘干,保持質量恒定,稱質量并記錄數據.

1.4 培養(yǎng)基優(yōu)化單因素試驗

培養(yǎng)基的初始條件為pH 6.0,接種量4 mL,裝液量20 mL/100mL三角瓶,溫度30℃,轉速180 r/min,搖床培養(yǎng)48 h.培養(yǎng)基選取碳源、氮源、生長因子、無機鹽等,研究其對菌株生物量的影響.

1.4.1 最適碳源的確定 分別取2 g葡萄糖、可溶性淀粉、蔗糖代替基礎培養(yǎng)基的碳源配制100 mL培養(yǎng)基（以下各成分的添加量均為配制100 mL培養(yǎng)基的添加量）,其他成分不變,進行發(fā)酵培養(yǎng).以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基為對照,每組3個平行,在波長560 nm條件下測定其OD值.

1.4.2 最適碳源添加量的確定 碳源確定后分別選取1、2、3、4、5 g添加量進行單因素試驗,每組3個平行,測定OD560值.

1.4.3 最適氮源的確定 分別取2 g蛋白胨、硫酸鈉、尿素代替基礎培養(yǎng)基的氮源配置100 mL培養(yǎng)基,其他成分一樣,進行發(fā)酵,以蛋白胨為氮源的培養(yǎng)基為對照,每組3個平行,測定OD560值.

1.4.4 最適氮源添加量的確定 氮源確定后分別選取1、2、3、4 g添加量進行單因素試驗,每組3個平行,測定OD560值.

1.4.5 磷酸鹽含量的確定 培養(yǎng)條件不變,分別選取0.01、0.05、0.1、0.2 g添加量進行單因素試驗,以基礎培養(yǎng)基為對照組,每組3個平行,測定OD560值.

1.4.6 最適無機鹽的確定 去掉基礎培養(yǎng)基中的所有無機鹽,分別添加0.05 g的氯化鈉、氯化鈣、硫酸鎂,以不添加任何無機鹽的發(fā)酵培養(yǎng)基為空白對照,進行發(fā)酵培養(yǎng),測定OD560值.

1.4.7 最適無機鹽含量的確定 無機鹽確定后分別選取0.01、0.05、0.1、0.2 g添加量進行單因素試驗,以基礎培養(yǎng)基為對照,每組3個平行,測定OD560值.

1.5 培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗

根據碳源、氮源、磷酸二氫鉀、無機鹽的單因素試驗結果,選出最佳碳源、氮源、無機鹽和磷酸二氫鉀添加量,采用L9（34）正交表安排試驗進行四因素三水平正交試驗,以OD560值為考察指標,對正交試驗的結果進行方差分析,進一步對發(fā)酵培養(yǎng)基組成進行優(yōu)化.

1.6 數據處理

采用SPSS 17.0軟件,對試驗數據進行方差分析.

2 結果與分析

2.1 碳源的確定

不同碳源對釀酒酵母生物量的影響見圖1.

圖1 不同碳源對OD560值的影響Fig.1 Effect of carbon source on OD560

由圖1可知,用葡萄糖、可溶性淀粉、蔗糖3種碳源與發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄糖進行對比,當可溶性淀粉為碳源時的菌體密度最低,蔗糖為碳源時的菌體密度最大,OD值高達1.216.方差分析結果顯示,葡萄糖作為碳源時與蔗糖作為碳源兩組間差異不顯著（P＞0.05）.由于蔗糖為多糖,含糖高,提供能量多,能更好地維持培養(yǎng)基內的低滲環(huán)境.因此,選擇蔗糖為釀酒酵母的最佳碳源.

2.2 蔗糖添加量的確定

蔗糖添加量對釀酒酵母生物量的影響見圖2.

圖2 蔗糖添加量對OD560值的影響Fig.2 Effect of sucrose consentration on OD560

由圖2可知,在蔗糖添加量低于4 g/100mL時,菌體濃度隨著蔗糖添加量的增加而增大,當蔗糖添加量大于4 g/100mL時酵母菌的生長受到抑制,蔗糖添加量為4 g/100mL時OD值高達1.508.蔗糖添加量在3、4、5 g/100mL時各組分間差異不顯著（P＞0.05）.從糖對釀酒酵母生物量的轉化率和經濟成本考慮,高質量濃度使釀酒酵母快速增長的同時代謝產物也快速大量積累,而一些有抑制作用的代謝產物會抑制釀酒酵母的增值,從而造成糖的浪費,又增加了投入成本.因此,確定適宜的蔗糖添加量為4 g/100mL.

2.3 氮源的確定

不同氮源對釀酒酵母生物量的影響見圖3.

圖3 不同氮源對OD560值的影響Fig.3 Effect of nitrogen source on OD560

由圖3可知,用蛋白胨為氮源時的菌體密度顯著高于硫酸銨、尿素為氮源時的菌體密度,OD值高達1.152,與對照組發(fā)酵培養(yǎng)基中的蛋白胨相差不大,因此,選用蛋白胨作為發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源.

2.4 蛋白胨添加量的確定

蛋白胨添加量對釀酒酵母生物量的影響見圖4.

圖4 蛋白胨添加量對OD560值的影響Fig.4 Effect of peptone consentration on OD560

由圖4可知,蛋白胨添加量為3 g/100mL時的OD值最大,為1.354.與添加量為4 g/100mL時的菌體濃度無顯著性差異（P＞0.05）,但高于1～2 g/100mL添加量時的菌體濃度.因此,蛋白胨添加量以3 g/100mL為宜.

2.5 磷酸二氫鉀添加量的確定

磷酸二氫鉀添加量對釀酒酵母生物量的影響見圖5.

圖5 磷酸二氫鉀添加量對OD560值的影響Fig.5 Effect of KH2PO4consentration on OD560

由圖5可知,磷酸二氫鉀添加量為0.05 g/100mL時的OD值最大,達1.194,并且與其他各組分間有顯著性差異（P＜0.05）.因此,選擇0.05 g/100mL添加量的磷酸二氫鉀為生長因子.

2.6 最適無機鹽的確定

不同無機鹽對釀酒酵母生物量的影響見圖6.

圖6 不同無機鹽對OD560值的影響Fig.6 Effect of inorganic salts on OD560

由圖6可知,選用氯化鈉、硫酸鎂、氯化鈣做無機離子時的菌體密度均高于對照組,但氯化鈉作為無機鹽時的OD值最大,高達1.377.方差分析結果表明,氯化鈉為無機鹽時與其他兩組分間有顯著性差異（P＜0.05）.因此選用氯化鈉作為無機鹽.

2.7 氯化鈉添加量的確定

氯化鈉添加量對釀酒酵母生物量的影響見圖7.

圖7 氯化鈉添加量對OD560值的影響Fig.7 Effect of NaCl consentration on OD560

由圖7可知,氯化鈉添加量為0.05g/100mL時的OD560值最大,高達1.353.與添加量為0.1、0.2 g/100mL時的菌體濃度無顯著性差異（P＞0.05）,但均高于0.01 g/100mL添加量時的菌體濃度.因此,從節(jié)約經濟成本考慮,確定氯化鈉添加量為0.05 g/100mL.

2.8 釀酒酵母培養(yǎng)基優(yōu)化優(yōu)化正交試驗分析

根據單因素試驗結果,選擇蔗糖添加量、蛋白胨添加量、磷酸二氫鉀添加量、氯化鈉添加量4個因素進行正交試驗,正交試驗因素與水平見表1,結果與分析見表2,方差分析見表3.

表1 釀酒酵母培養(yǎng)基配方優(yōu)化正交試驗因素與水平Tab.1 Factors and levels of orthogonal experiment for medium formula optimization of Saccharomyces cerevisiae

表2 釀酒酵母培養(yǎng)基配方優(yōu)化正交試驗結果與分析Tab.2 Results and analysis of orthogonal experiment for medium formula optimization of Saccharomyces cerevisiae

表3 釀酒酵母培養(yǎng)基配方優(yōu)化正交試驗方差分析Tab.3 Variance analysis of orthogonal experiment for medium formula optimization of Saccharomyces cerevisiae

由正交試驗結果可知,影響釀酒酵母發(fā)酵水平的主次因素關系為A＞B＞C＞D,即蔗糖對釀酒酵母的影響最大,其次是蛋白胨和氯化鈉,磷酸二氫鉀影響最小.釀酒酵母最優(yōu)培養(yǎng)基組合為A3B2C4D4,即蔗糖、蛋白胨、磷酸二氫鉀、氯化鈉的添加量分別為4、3、0.1和0.1 g/100mL.3次重復驗證試驗結果表明該組合確為釀酒酵母的最適發(fā)酵培養(yǎng)基.在此培養(yǎng)條件下,OD560值為1.611,比未優(yōu)化培養(yǎng)基提高了36.2%,酵母菌的干質量達到17.5 g/L,比未優(yōu)化培養(yǎng)基提高了36.9%.

極差分析結果表明,磷酸二氫鉀對試驗結果影響最小,因此把磷酸二氫鉀作為誤差項來檢驗其他因素的顯著性.方差分析結果表明,A的F值＞F0.05=19,即蔗糖添加量對釀酒酵母OD560值影響顯著,而其他因素F值均小于F0.05,說明蛋白胨、磷酸二氫鉀、氯化鈉對釀酒酵母發(fā)酵無顯著影響.

3 結論與討論

微生物在生長繁殖過程中需要不斷從外界環(huán)境中攝入各種營養(yǎng)物質,并且將這些營養(yǎng)物質用于細胞的生長繁殖.一般培養(yǎng)基中含有水、碳源、氮源、無機鹽、生長因子、微量元素等,培養(yǎng)基中的這些營養(yǎng)成分是制約釀酒酵母發(fā)酵水平的因素.前人大多通過優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件來提高酵母菌體濃度,楊士春[9]等采用響應面法研究釀酒酵母的優(yōu)化,得出在酵母發(fā)酵生產過程中,向培養(yǎng)基中添加0.286 g/L的磷酸二氫鉀、0.975 g/L的硫酸鎂和5.877 g/L的尿素,能使乙醇產量達到最佳值.王美霞[10]等對YPD培養(yǎng)基、豆芽汁培養(yǎng)基、麥氏培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基和馬鈴薯培養(yǎng)基5種培養(yǎng)基經過初篩后,通過正交試驗優(yōu)化培養(yǎng)基組成,優(yōu)化后的OD值是基礎培養(yǎng)基的1.06倍.李聰[8]對釀酒酵母培養(yǎng)條件和發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化,得到優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基配方為葡萄糖20 g/L,酵母粉10 g/L,磷酸二氫鉀1.5 g/L,硫酸鎂1 g/L,并得出結論：影響釀酒酵母生長的關鍵因素是搖瓶培養(yǎng)時間和培養(yǎng)基中的葡萄糖質量濃度.

本研究通過單因素試驗和正交試驗優(yōu)化了釀酒酵母的發(fā)酵培養(yǎng)基,最終優(yōu)化的培養(yǎng)基配方為：蔗糖、蛋白胨、磷酸二氫鉀、氯化鈉的添加量分別為4、3、0.1和0.1 g/100mL.在此培養(yǎng)條件下,OD560值為1.611,比未優(yōu)化培養(yǎng)基提高了36.2%,酵母菌的干質量達到17.5 g/L,比優(yōu)化前高了36.9%.

[1]趙小麗,甄玉國,王蘭惠,等.釀酒酵母發(fā)酵條件的研究[J].中國釀造,2014,33（6）：75-78.

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（責任編輯：鄧天福）

The optimization of Saccharomyces cerevisiae medium

Zhang Lei1,Huang Rongkai1,Hu Xigui1,Yu Yongang2
（1.Henan Institute of Science and Technology,Xinxiang 453003,China；2.Northwest A&F University, Yangling 712100,China）

In order to improve the biomass of Saccharomyces cerevisiae,the experiment adopts the method combined single-factor test with orthogonal test,optimizing the medium components of S.cerevisiae.The results showed that the optimized medium included 4 g sucrose,3 g peptone,0.1 g potassium dihydrogen phosphate,0.1 g sodium chloride per 100 mL.Using this fermentation medium to ferment,the biomass of S.cerevisiae is 17.5 grams per litre up by 36.9%, compared with the optimization of medium 12.78 gram per litre before,and the value of OD560is 1.611,increased by 36.2%than the optimized amount of culture medium.

Saccharomyces cerevisiae；orthogonal test；medium；optimiz

TS261.1+1

A

：1008-7516（2015）04-0018-06

10.3969/j.issn.1008-7516.2015.04.004

2015-06-24

河南科技學院引進高層次人才科研啟動項目（201010613001）

張蕾（1987―）,女,河南衛(wèi)輝人,碩士,助理實驗師.主要從事微生物發(fā)酵研究.