胡麗慶，王 盛，史煜波，翁幸鐾

產(chǎn)氣腸桿菌連續(xù)分離株的耐藥性及β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥機(jī)制的研究

胡麗慶，王 盛，史煜波，翁幸鐾

目的 探討臨床連續(xù)分離的產(chǎn)氣腸桿菌耐藥性及耐碳青霉烯類藥物菌株對β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥的主要機(jī)制。方法 用Vitek2-Compact儀對臨床連續(xù)分離的240株產(chǎn)氣腸桿菌進(jìn)行鑒定和常規(guī)藥敏試驗(yàn)，并篩選出耐碳青霉烯類藥物的菌株；用瓊脂稀釋法測定其對碳青霉烯類藥物的MIC值；用改良的三維試驗(yàn)方法分別檢測耐藥菌株的ESBLs與AmpC酶；改良Hodge試驗(yàn)法檢測碳青霉烯酶；用PCR擴(kuò)增法檢測3種β-內(nèi)酰胺酶的耐藥基因；結(jié)果 240株產(chǎn)氣腸桿菌對23種常用抗生素的耐藥率在3.8%～100%之間，最高為頭孢西丁(100%)、最低為亞胺培南(3.8%)；篩選出10株耐碳青霉烯類產(chǎn)氣腸桿菌；三維試驗(yàn)10株菌ESBLs 及AmpC酶均為陽性，Hodge試驗(yàn)陽性7株。PCR結(jié)果示，攜帶blaKPC基因7株；攜帶blaCTX-M基因7株，攜帶blaSHV基因2株；攜帶blaDHA基因6株，攜帶blaACT/MIR型ampC基因4株； 16SrRNA基因定量確定ampC基因的表達(dá)增加的3株。結(jié)論 產(chǎn)氣腸桿菌對臨床常用抗菌藥物具有較高的耐藥性，其主要耐藥機(jī)制為產(chǎn)碳青霉烯酶、ESBLs與AmpC酶。

產(chǎn)氣腸桿菌；blaKPC；ESBLs；ampC基因

Supported by the Zhejiang Medicine and Health Scientific Research Fund (No. 2011KYB099)

產(chǎn)氣腸桿菌是條件致病菌，隨著各種抗生素的廣泛使用，在醫(yī)院的感染中呈不斷上升趨勢。研究發(fā)現(xiàn)耐藥菌株產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶是其對β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥的主要機(jī)制，此種機(jī)制造成的細(xì)菌耐藥占到耐藥菌株的80%[1]。但近些年來有關(guān)產(chǎn)氣腸桿菌耐藥機(jī)制的研究報(bào)道相對較少，筆者對240株從臨床連續(xù)分離的菌株進(jìn)行了相關(guān)耐藥情況分析與耐藥機(jī)制的研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 2009年1月至2012年7月從本院不同病區(qū)連續(xù)分離的產(chǎn)氣腸桿菌保存菌株240株。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922，肺炎克雷伯菌ATCC700603購自衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心。

1.2 儀器與試劑 全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)Vitek2-Compact及配套試劑革蘭陰性桿菌鑒定卡(GNI)、革蘭陰性桿菌藥敏卡(GNS)均購自法國梅里埃公司；PE-9700 PCR儀(美國ABI公司)；Eppendorf 5417R高速離心機(jī)(德國艾本得)；Bio-Rad GelDoc凝膠電泳成像分析系統(tǒng) (美國伯樂公司)；MH瓊脂干粉，頭孢西丁紙片(FOX)，頭孢曲松紙片(CRO)均購自英國OXOID公司；鄰氯西林(CLO)，克拉維酸(CA)均購自上海四藥有限公司，亞胺培南(IPM)、厄他培南(ETP)藥物粉劑購自杭州默沙東醫(yī)藥公司；厄他培南藥敏紙片由杭州默沙東醫(yī)藥公司贈(zèng)送；美洛培南(MEM)藥物粉劑購自日本住友制藥有限公司；PCR通用試劑盒EmeraldAmpTMPCR Master Mix及DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2,000TMDNA Marker均為寶生物工程(大連)有限公司新產(chǎn)品，6種碳青霉烯類酶耐藥基因的引物blaKPC、blaNDM-1、blaGES、blaSME、blaIMI-1 /NmcA和blaSHV-38；5種超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因；AmpC酶基因blaDHA和blaACT/MIR；AmpC基因表達(dá)檢測的16SRNA引物及探針(見表1)均由生工生物工程(上海)有限公司合成。

表1 5種超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因和2種AmpC酶基因的引物及擴(kuò)增產(chǎn)物的大小

1.3 菌株鑒定及常規(guī)藥敏試驗(yàn) 按全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)Vitek2-Compact及配套試劑革蘭陰性桿菌鑒定卡(GNI)和革蘭陰性桿菌藥敏卡(GNS)使用說明書。對篩選出的10株耐碳青霉烯類藥物的產(chǎn)氣腸桿菌進(jìn)行重新鑒定與藥物敏感性試驗(yàn)，確定菌株鑒定正確及對碳青霉烯類藥物仍然耐藥。

1.4 MIC值測定 用M-H瓊脂稀釋法測定亞胺培南、美羅培南、厄他培南、阿米卡星、頭孢哌酮/舒巴坦對篩選出的10株耐碳青霉烯類藥物的產(chǎn)氣腸桿菌的最低抑菌濃度(MIC)，方法參照CLSI標(biāo)準(zhǔn)。操作如下，將不同劑量的藥物，加入融化并冷至50 ℃左右的定量MH瓊脂中，制成含不同遞減濃度抗菌藥物的平板(濃度梯度分別為：0.5、1、2、4、8、16、32、64、128 μg/mL瓊脂)，接種受試菌，孵育后觀察細(xì)菌生長情況，將平板置于暗色、無反光物體表面上判斷試驗(yàn)終點(diǎn)，以抑制細(xì)菌生長的瓊脂平板所含最低藥物濃度為MIC。

1.5 改良的Hodge試驗(yàn) 參照CLSI標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行[2]，0.5麥?zhǔn)蠞岫葐挝淮竽c埃希菌ATCC25922菌液10倍稀釋后均勻涂布MH平板，中間貼上ETP(10 μg)紙片，再用無菌接種環(huán)自紙片外緣向平板邊緣劃線，35 ℃孵育16～18 h后觀察結(jié)果，結(jié)果判斷：厄他培南抑菌圈內(nèi)出現(xiàn)待檢菌矢狀生長者為產(chǎn)碳青霉烯酶菌株。

1.6 超廣譜β-內(nèi)酰胺酶及AmpC酶的表型檢測 采用頭孢曲松的三維試驗(yàn)方法[3]檢測超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)；采用頭孢西丁的三維試驗(yàn)法[4]檢測AmpC酶。

1.7 模板DNA的提取 10株碳青霉烯類藥物耐藥的產(chǎn)氣腸桿菌經(jīng)血瓊脂平板36 ℃培養(yǎng)18 h后，取菌落于裝有150 μL純水的無菌離心管中成菌懸液，于100℃水浴中煮15 min，冷卻后于高速離心機(jī)中離心8 000 r/min,5 min,取上清液(模板DNA)-20 ℃保存待用。

1.8 多種β-內(nèi)酰胺酶的基因檢測 用PCR法檢測10株碳青霉烯類藥物耐藥的產(chǎn)氣腸桿菌的6種碳青霉烯酶基因，blaKPC、blaNDM-1、blaGES、blaSME、blaIMI-1 / NmcA和blaSHV-38，具體的操作方法，見參考文獻(xiàn)[5]；5種超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因blaCTX-M1、blaCTX-M2、blaCTX-M9、blaTEM、blaSHV-38；2種AmpC酶基因blaDHA和blaACT/MIR并測序，操作方法參考文獻(xiàn)[6]。

1.9 AmpC基因表達(dá)檢測 使用qRT-PCR法檢測定量16S rRNA基因定量確定ampC基因表達(dá)，以臨床分離ampC基因檢測陰性，亞胺培南、美羅培南均敏感的產(chǎn)氣腸桿菌作為本底對照1，以倍數(shù)來確定表達(dá)情況，具體操作見文獻(xiàn)[7]。

2 結(jié) 果

2.1 常規(guī)藥敏試驗(yàn)結(jié)果 240株產(chǎn)氣腸桿菌對常用23種抗菌藥物的耐藥性檢測結(jié)果，耐藥率最高的為頭孢西丁100%，其次為頭孢唑林91.2%；耐藥率最低的為亞胺培南3.8%,其次為美洛培南4.4%。對其他抗菌藥物的耐藥性檢測結(jié)果見表2。

2.2 MIC值測定結(jié)果 10株碳青霉烯類耐藥的產(chǎn)氣腸桿菌對7種抗菌藥物的瓊脂稀釋法檢測的MIC值結(jié)果見表3。

表2 240株產(chǎn)氣腸桿菌對常用23種抗菌藥物的耐藥性檢測結(jié)果

表3 10株碳青霉烯類耐藥的產(chǎn)氣腸桿菌對7種抗菌藥物的MIC值(μg/mL)

2.3 改良Hodge試驗(yàn)、ESBLs及AmpC酶表型檢測及耐藥基因檢測結(jié)果 10株碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的產(chǎn)氣腸桿菌，三維試驗(yàn)ESBLs及AmpC酶均陽性，Hodge試驗(yàn)陽性7株；6種碳青霉烯酶基因中檢測到blaKPC基因陽性7株，未檢測到blaNDM-1、blaGES、blaSME、blaIMI-1 / NmcA和blaSHV-38基因；ESBLs基因BlaCTX-M陽性7株，BlaSHV陽性2株；AmpC酶基因blaDHA陽性6株，blaACT/MIR陽性4株；16S rRNA基因定量確定ampC基因的表達(dá)增加的3株分別為1，4，7號產(chǎn)氣腸桿菌，qRT-PCR擴(kuò)增圖及相對表達(dá)量見圖1與圖2，其他結(jié)果詳見表4。

表4 10株碳青霉烯類藥物耐藥菌株耐藥基因檢測結(jié)果

3 討 論

產(chǎn)氣腸桿菌為腸桿菌科常見細(xì)菌，是菌血癥中的主要病原菌，其死亡率可達(dá)10.2%[8]。有關(guān)報(bào)道顯示，產(chǎn)氣腸桿菌對臨床常用的抗菌藥物具有較高的耐藥率[9],而本院連續(xù)分離的240株產(chǎn)氣腸桿菌耐藥敏率略底于文獻(xiàn)報(bào)道，藥敏結(jié)果表2顯示對常

Three strains overproduced AmpC β-lactamase, no. 1, 4, and 7 curves in this map.

圖1 熒光實(shí)時(shí)定量qRT-PCR檢測AmpC基因表達(dá)的16SRNA擴(kuò)增圖

Fig.1 Amplification plot of real-time quantitative PCR for the testing chromosomal 16S rRNA ofampCgenes expression

1-10:Relative expression level ofampCgenes for 10 strains; ntc: Negative control (reference strain)

圖2 10株碳青霉烯類耐藥的產(chǎn)氣腸桿菌AmpC基因相對表達(dá)量

Fig.2 Relative expression level ofampCgenes for 10 strains of carbapenems resistantEnterobacteraerogens

用抗菌素耐藥率最高的是一代、二代頭孢及頭霉素類(頭孢唑啉、頭孢呋辛及頭孢西丁均大于90%)和氨芐西林73.9%；耐藥率相對較低的是頭孢曲松41.2%、頭孢吡肟32.5%，由于革蘭陰性菌產(chǎn)ESBLs 的比例較高，產(chǎn)AmpC酶菌的比例在增加，三代頭孢作為醫(yī)院內(nèi)中、重度感染首選的安全性在降低，而第四代頭孢菌素的頭孢吡肟因能快速通過細(xì)菌外膜屏障對高產(chǎn)AmpC酶細(xì)菌的抗菌活性較好，若細(xì)菌不產(chǎn)生ESBLs等，可考慮選用；碳青霉烯類美洛培南、亞胺培南和氨基糖苷類阿米卡星的耐藥率最低，均低于5%，且碳青酶烯類抗菌藥物對絕大多數(shù)β-內(nèi)酰胺酶，包括超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)和AmpC穩(wěn)定，對腸桿菌科細(xì)菌一直保持很高的抗菌活性，是目前治療腸桿菌科細(xì)菌感染最有效的抗菌藥物[10]，但針對目前出現(xiàn)的為數(shù)不少的耐藥株應(yīng)當(dāng)引起臨床和實(shí)驗(yàn)室的重視；其中酶抑制劑復(fù)合制劑的耐藥率氨芐西林/舒巴坦>阿莫西林/克拉維酸>哌拉西林/他唑巴坦,分別為65.3%、25.8%、23.1%，產(chǎn)AmpC酶是產(chǎn)氣腸桿菌對三代頭孢菌素和酶抑制劑復(fù)合制劑產(chǎn)生耐藥的主要原因，復(fù)合制劑對ESBLs有效，對AmpC酶無效，覆蓋面更廣危重感染仍然以碳青霉烯類為首選。

為進(jìn)一步深入了解本院產(chǎn)氣腸桿菌的耐藥機(jī)制，本研究對篩選出的10株碳青霉烯類藥物耐藥菌株進(jìn)行多種β-內(nèi)酰胺酶的檢測。表4結(jié)果顯示， ESBLs 和AmpC酶均陽性，7株Hodge試驗(yàn)陽性。PCR結(jié)果顯示，本院的碳青霉烯酶以blaKPC2為主。KPC型碳青霉烯酶是一種非金屬碳青霉烯酶，可水解碳青霉烯類、青霉素類、頭孢菌素類和氨曲南等抗菌藥物，也是產(chǎn)氣腸桿菌耐碳青酶類藥物的重要原因；本院產(chǎn)氣腸桿菌攜帶ESBLs的基因有多種，以blaCTX-M和blaSHV為主AmpC酶基因以blaDHA和blaACT/MIR型為主；對AmpC酶過表達(dá)株的研究顯示，其中1、4、7號菌株16SrRNA基因定量表達(dá)明顯增加，分別為87.7、102.2、96.3。文獻(xiàn)報(bào)道AmpC酶過度表達(dá)可造成菌株對碳青霉烯類藥物的耐藥[7]，本研究結(jié)果顯示，此3株過度表達(dá)菌，雖然碳青酶烯類藥物耐藥的多種基因陰性，但仍對亞胺培南與美洛培南耐藥也說明這一耐藥機(jī)制的存在。研究還表明，菌株同時(shí)攜帶多種耐藥基因的重疊組合，這使細(xì)菌的耐藥性起到了疊加或協(xié)同作用。

抗菌藥物尤其是三代頭孢菌素的應(yīng)用與ESBLs的感染流行有相關(guān)性，有報(bào)道ESBLs的暴發(fā)流行與頭孢他啶的消耗量成正相關(guān)，而限制頭孢他啶的使用，則可減少ESBLs菌的流行[11-12]。而質(zhì)粒介導(dǎo)的AmpC酶在細(xì)菌中的傳播已呈增長趨勢，新的質(zhì)粒AmpC酶亞型在不同細(xì)菌中層出不窮。且由于質(zhì)粒有傳遞性，此類酶可在不同細(xì)菌間傳播，容易引起暴發(fā)流行[13]。在國外，質(zhì)粒介導(dǎo)AmpC酶以CMY-2型最為流行[14]，而本研究基因測序結(jié)果顯示主要為blaDHA和blaACT/MIR型，表明我國的流行株與國外有所不同。鑒于AmpC酶可被β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物誘導(dǎo)，屬于誘導(dǎo)酶，不被克拉維酸抑制但可被氯唑西林抑制[15]，目前第四代頭孢和碳青霉烯類仍然是治療產(chǎn)AmpC酶菌株的有效藥物，臨床經(jīng)驗(yàn)性用藥一般首選碳青霉烯類，其次是β-內(nèi)酰酶類藥物和酶抑制劑、頭霉類抗菌藥物及其他敏感抗菌藥物。但為了避免產(chǎn)生金屬β-內(nèi)酰胺酶，臨床上在使用碳青霉烯類藥治療時(shí)還是應(yīng)考慮聯(lián)合用藥。

不斷出現(xiàn)的產(chǎn)酶耐藥株給臨床抗菌治療帶來了極大的困難，對臨床連續(xù)分離菌株進(jìn)行耐藥性及耐藥機(jī)制的檢測能明確某一階段耐藥菌株的耐藥性變化，這有利于耐藥基因分子流行機(jī)制的研究。臨床實(shí)驗(yàn)室及時(shí)準(zhǔn)確地對某一階段臨床分離菌株進(jìn)行耐藥菌株的監(jiān)測，對規(guī)范臨床抗生素的合理選用，控制耐藥菌株的播散和流行，具有非常重大的意義。

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Drug-resistance on consecutive clinical isolates
ofEnterobacteraerogenesand its resistance mechanism to β-lactamses

HU Li-qing,WANG Sheng,SHI Yu-bo,WENG Xing-bei

(ClinicalLaboratory,theFirstHospitalofNingboCity,Ningbo315000,China)

The aim is to investigate the antibiotics resistance of consecutive clinical isolates ofEnterobacteraerogensand the main resistance mechanism to β-lactamses for carbapenems resistant isolates. The Vitek 2-Compact instrument was used to identify the 240 strains ofEnterobacteraerogensfrom clinic, and the antimicrobial susceptibility was tested, while the carbapenems-resistant isolates were screened. The minimum inhibition concentration of carbapenems was tested by standard agar dilution method. The ESBLs and AmpC β-lactamase were detected with three-dimensional test. The KPC carbapenemase were detected by Hodge test and the genotypes of β-lactamses were performed by PCR method. Results showed that the resistance rates of 240Enterobacteraerogensstrains to the common antibiotics were from 3.8% to 100%. The highest one was cefoxitin (100%), and the lowest was imipenem (3.8%). Ten carbapenems-resistant strains ofEnterobacteraerogenswere screened from 240 isolates. Both ESBLs and AmpC β-lactamase were positive in all of 10 isolates, and 7 isolates in Hodge test were positive. PCR experiment showed that among the 10 strains, there were 7 strains carryingblaKPC, 7 strains carryingblaCTX-M, 2 strains carryingblaSHV, 6 strains carryingblaDHA, 4 strains carryingblaACT/MIR, and 2 strains carrying high expression levels of the chromosomalampCgene. It’s suggested that there is high antibiotic resistance to common antimicrobial agents of clinicalEnterobacteraerogens. The main cause for antibiotics resistance ofEnterobacteraerogensis producing β-lactamase such as carbapenemase, ESBLs and AmpC bate-lactamase.

Enterobacteraerogens;blaKPC; ESBLs; AmpC β-lactamase

寧波市第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，寧波 315000 Email:54256998@qq.com

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.02.012

R378

A

1002-2694(2015)02-0148-06

2014-05-28；

2014-10-26

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科學(xué)研究基金(2011KYB099)