韋小瑜，游 旅，田克誠，唐光鵬，王定明

貴州省首次從腹瀉病例中檢出腸出血性大腸桿菌O157∶H7

韋小瑜，游 旅，田克誠，唐光鵬，王定明

目的 從貴州省1例腹瀉病例的糞便標本中分離鑒定O157腸出血性大腸桿菌并對其進行毒力基因檢測。方法 收集腹瀉病例的糞便標本，mEC肉湯增菌后，采用O157膠體金進行初篩，陽性者增菌液經(jīng)免疫磁珠富集后進行腸出血性大腸桿菌的分離，對分離株進行系統(tǒng)生化鑒定，O157、H7診斷血清凝集，應(yīng)用特異性PCR進行rfbE和fliC基因鑒定，以及stx1、stx2、eaeA和hlyA 4種毒力基因檢測。結(jié)果 腹瀉病例糞便標本經(jīng)mEC肉湯增菌后，檢測O157膠體金陽性；增菌液經(jīng)免疫磁珠富集后培養(yǎng)出可疑菌落，經(jīng)系統(tǒng)生化鑒定為大腸桿菌，血清型為O157∶H7；PCR檢測O抗原特異性rfbE基因和H7特異性fliC基因均陽性；毒力基因eaeA、stx2和hly均陽性，stx1陰性。結(jié)論 分離株確診為腸出血性大腸桿菌O157∶H7，為貴州省腹瀉病例中首株該病原體。

腸出血性大腸桿菌O157∶H7；貴州；腹瀉；PCR；毒力基因

Supported by Science and Technology Fund of the Health Department of Guizhou Province (No. gzwkj2013-1-079) and grants from the National Key Program for Infectious Disease of China (No. 2012ZX10004-212)

腸出血性大腸桿菌(EnterohemorrhagicEscherichiacoli,EHEC)是一種重要的人獸共患病原菌，該菌主要定居于動物的腸道內(nèi)，通過污染的水源及食物引起人和動物感染。腸出血性大腸桿菌(EHEC)有多種血清型，主要包括O157∶H7，O26∶H11和O111等幾種血清型，其中毒力最強的血清型是O157∶H7。EHEC O157∶H7感染宿主后除可使人發(fā)生常規(guī)腹瀉外，還可在5%～10%的病例中導(dǎo)致溶血性尿毒綜合征、血栓性血小板減少等嚴重并發(fā)癥，甚至死亡[1]。世界各地包括中國都有不同規(guī)模的暴發(fā)流行。我國自1986年已先后在江蘇、山東、河南、安徽、浙江等十多個省市發(fā)現(xiàn)了O157∶H7感染病例。2014年4月，在貴陽市，從1例腹瀉病例的糞便標本中分離出EHECO157∶H7。

1 材料與方法

1.1 病例資料 患者男性，1歲2月，散居兒童，家住貴州省貴陽市花溪區(qū)，為感染性腹瀉散發(fā)病例，于就診3 d前出現(xiàn)發(fā)熱38 ℃，腹瀉，水樣便，5次/d，無嘔吐、腹痛、粘液血便，周圍無類似病人，就診前曾采用口服補液治療，收集患者標本前未服用過抗生素治療，未做過糞便常規(guī)檢測。

1.2 主要試劑和儀器 mEC肉湯增菌液購自北京友康基業(yè)生物公司，大腸桿菌O157膠體金檢測試劑盒購自鄭州萬泰，O157免疫磁珠購自挪威英俊公司，O157、H7診斷血清購自寧波天潤，O157顯色培養(yǎng)基購自法國柯瑪嘉，API20E生化鑒定板條購自法國梅里埃。PCR儀為德國80W-Tprofessional Gradient 96；凝膠成像儀為Gel Doc2000型(Bio-Rad，美國)。引物合成由上海生工生物公司完成。實驗菌株為1例腹瀉病例糞便標本中分離的EHEC O157∶H7疑似菌株，編號GZ2014037，O157∶H7標準株NCTC12900購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.3 傳統(tǒng)方法鑒定EHEC O157∶H7 腹瀉病例標本經(jīng)mEC 增菌后，進行大腸桿菌O157膠體金檢測，膠體金陽性者mEC增菌液進行O157免疫磁珠(IMS)富集后轉(zhuǎn)種至O157顯色培養(yǎng)基，觀察菌落生長時間、形態(tài)、菌落染色、系統(tǒng)生化鑒定、O157和H7診斷血清凝集。

1.4 DNA提取 挑取O157∶H7腸出血性大腸桿菌可疑菌落接種至血平板培養(yǎng)18 h后，采用大連寶生物DNA提取試劑盒，按照試劑盒說明書步驟提取細菌DNA。

1.5 特異性PCR鑒定 采用PCR方法，按照參考文獻[2]提供的O157菌體抗原特異基因rfbE和鞭毛抗原H7特異基因flic的引物序列和參數(shù)對實驗菌株GZ2014037核酸進行擴增，同時采用O157∶H7標準株核酸作為陽性對照，超純水作為陰性對照。

1.6 毒力基因檢測 采用PCR方法，按照參考文獻[2-4]提供的引物序列和擴增程序，見表1，對實驗菌株GZ2014037和EHECO157∶H7標準株的核酸進行stx1、stx2、Hly、eaeA 4種毒力基因檢測，超純水作為陰性對照。

表1 實驗用引物

2 結(jié) 果

2.1 大腸桿菌O157膠體金檢測 腹瀉病例糞便標本mEC肉湯增菌液大腸桿菌O157膠體金檢測有兩條紅線出現(xiàn)，即在檢測線和質(zhì)控線位置均出現(xiàn)紅線，判斷為陽性。

2.2 菌落形態(tài)及染色鑒定 O157膠體金陽性的mEC肉湯增菌液進行O157免疫磁珠(IMS)富集后轉(zhuǎn)種至O157顯色培養(yǎng)基，36 ℃培養(yǎng)過夜后可見大小約0.5～1 mm、圓形、邊緣整齊、表面光滑濕潤、中心褐色周圍淡紫色可疑菌落，對可疑菌落進行革蘭染色鏡檢，結(jié)果為革蘭染色陰性、無芽孢桿菌。

2.3 系統(tǒng)生化鑒定 將初步鑒定符合O157大腸桿菌的實驗菌株GZ2014037進行API20E系統(tǒng)生化鑒定，結(jié)果O157大腸桿菌疑似菌株系統(tǒng)生化鑒定為大腸桿菌，API20E生化編碼為5144152，鑒定度為97.7%。

2.4 診斷血清凝集結(jié)果 實驗菌株GZ2014037使用大腸桿菌O157診斷血清進行玻片凝集，凝集強度為(++++)，相應(yīng)菌株再用H7進行血清凝集，凝集強度為(++)，同時用O157∶H7標準菌株作為陽性對照，無菌生理鹽水作為陰性對照。

2.5 特異性PCR鑒定結(jié)果 采用PCR方法對實驗菌株GZ2014037和標準菌株NCTC12900核酸進行擴增，結(jié)果顯示本次分離菌株及標準菌株均獲得259 bp(rfbE基因)和547 bp(flic基因)特異性擴增片斷，而陰性對照無條帶擴增。

2.6 毒力基因檢測結(jié)果 采用PCR方法對實驗菌株GZ2014037和標準株NCTC12900核酸進行檢測，產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖進行電泳，結(jié)果實驗菌株GZ2014037獲得384 bp(eaeA基因)、285 bp(stx2基因)、534 bp(hly基因)的特異性擴增片斷，無stx1條帶擴增，標準株獲得384 bp(eaeA基因)、534 bp(hly基因)的特異性擴增片斷，陰性對照無條帶出現(xiàn)。

3 討 論

貴州省近5年其他感染性腹瀉(除霍亂、菌痢、傷寒副傷寒)發(fā)病率逐年增高，由2008年14.98/10萬上升至2012年25.97/10萬，其發(fā)病率僅次于手足口病，居腸道傳染病第2位。貴州省引起腹瀉的常見病原有沙門、彎曲菌、輪狀病毒、諾如病毒等[5-6]，而由腸出血性大腸桿菌O157引起的腹瀉病例至今未見報道。

腹瀉病例中腸出血性大腸桿菌O157的檢測程序，常采用大腸桿菌O157膠體金對標本進行初篩，初篩陽性的進行IMS富集獲得分離菌株，為大腸桿菌O157∶H7病原學(xué)檢測的最佳程序，因大腸桿菌O157膠體金特異性強、靈敏度高，操作簡便、快速，可對標本進行快速篩查，減少工作量，有助于及時診斷并確定治療方案，尤其適合各級疾控中心和臨床檢驗部門使用[7]。本文對1例腹瀉病例糞便標本進行mEC肉湯增菌后，檢測大腸桿菌O157膠體金陽性，對增菌液進行IMS富集后分離到疑似腸出血性大腸桿菌GZ2014037，經(jīng)傳統(tǒng)方法鑒定為腸出血性大腸桿菌O157∶H7，為貴州省腹瀉病例中首株腸出血性大腸桿菌O157∶H7病原菌。

為了從分子生物學(xué)水平證實該分離株，采用特異性PCR方法進行鑒定，結(jié)果O157菌體抗原特異基因rfbE和鞭毛抗原H7特異基因flic均陽性。脂多糖是細菌的表面抗原，具有重要的診斷和鑒定價值，rfbE基因是編碼O157∶H7的脂多糖基因。針對編碼H7鞭毛抗原的基因fliC設(shè)計的引物, 能特異地檢測到H7基因, 對特異地檢出大腸桿菌O157∶H7有輔助鑒定作用[8]。該方法在腹瀉病例和動物來源的菌株檢測中得到廣泛應(yīng)用[9]。本研究中GZ2014037菌株經(jīng)特異性PCR檢測為腸出血性大腸桿菌O157∶H7，與傳統(tǒng)方法檢測結(jié)果一致。

大腸埃希菌O157∶H7主要依靠它產(chǎn)生的志賀毒素、溶血素和對上皮細胞的粘附素引起人體的損害。其中志賀毒素( Shiga toxin, Stx ) 包括stx1和stx2, 是引起人類溶血性尿毒綜合征和血栓性血小板減少性紫癜的主要毒力因子, 分別由stx1、stx2基因編碼。而由hlyA和eaeA基因編碼的溶血素和對上皮細胞的粘附素也是重要的致病因子[8]。為了解貴州省GZ2014037分離株的毒力基因攜帶情況，本研究采用PCR方法，對該菌株進行毒力基因檢測，發(fā)現(xiàn)貴州省首次從腹瀉病例中分離的O157∶H7腸出血性大腸桿菌攜帶eaeA基因、stx2基因及hly基因，為強毒株。1996-1999年貴州省曾從仔豬中檢出O157大腸桿菌3株[10]，但至今一直未從病人中分離到O157∶H7腸出血性大腸桿菌。本研究從腹瀉病例中分離到腸出血性大腸桿菌，是迄今為止貴州省首次從腹瀉病例中分離到腸出血性大腸桿菌O157∶H7，說明貴州省腹瀉人群中存在腸出血性大腸桿菌O157∶H7的感染，應(yīng)加強對該病原菌的監(jiān)測。

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Isolation and identification of the first strain ofEnterohemorrhagicEscherichiacoliO157∶H7 isolated from a patient with infectious diarrhea in Guizhou Province, China

WEI Xiao-yu,YOU Lü,TIAN Ke-cheng,TANG Guang-peng,WANG Ding-ming

(ResearchInstituteofInfectiousDiseaseControlandPrevention,GuizhouProvincialCenterforDiseaseControlandPrevention,Guiyang550004,China)

In this study, we aimed to isolate and identifyEnterohemorrhagicEscherichiacoliO157∶H7 from a patient with infectious diarrhea in Guizhou Province, and then detect virulence genes. Feces from a diarrhea patient were enriched in mEC broth. TheE.coliO157 was primary screened by Gold-immunochromatograpy assay (GICA), then followed by immunomagnetic bead separation (IMS) for the isolation ofEHECO157 from positive enrichment medium. Isolates were conducted with biochemical identification, sero-groups testing, specific PCR identification and virulence genes detection. Results showed that GICA was positive andEHECO157 suspicious colonies were cultured by IMS. The strain was identified asE.coliO157∶H7 by sero-type and specific PCR. The virulence genes ofeaeA,stx2 andhlywere tested positive, and thestx1 was negative. The laboratory diagnostic result showed that the isolate from a patient with infectious diarrhea wasEHECO157∶H7. It is the firstEHECO157∶H7 strain isolated from a patient with infectious diarrhea in Guizhou Province.

EnterohemorrhagicEscherichiacoliO157∶H7; Guizhou; diarrhea; PCR; virulence genes

國家科技重大專項(No.2012ZX10004-212)和貴州省衛(wèi)生科技基金(No.gzwkj2013-1-079)聯(lián)合資助

貴州省病癥預(yù)防控制中心，貴陽 550004；Email:weixyuse@foxmail.com

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.02.019

R378

B

1002-2694(2015)02-0183-03

2014-06-30；

2014-12-07