劉志國，崔步云，劉日宏，王 妙, 解新霞, 李曉琳, 夏咸柱

布魯菌分子分型方法應(yīng)用研究進(jìn)展

劉志國1,2,3，崔步云4，劉日宏3，王 妙3, 解新霞3, 李曉琳3, 夏咸柱1,5

布魯菌屬細(xì)菌是布病的病原菌。當(dāng)前，用于布魯菌屬細(xì)菌分型的方法有多種，而布魯菌分子分型方法在布病的分子流行病學(xué)調(diào)查、病原菌的快速分型鑒定、病原菌的溯源分析和菌株之間差異關(guān)系的分析過程中被廣泛應(yīng)用并具有十分重要的作用。本文就常用的布魯菌的核酸探針技術(shù)(DNA probes)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、實(shí)時定量PCR(Real-time PCR)、16SrDNA鑒定、PCR限制性片段長度多態(tài)性( PCR-RFLP)、單核苷酸多態(tài)性分析(SNP)、脈沖場凝膠電泳(PFGE)、多位點(diǎn)序列分型(MLST)、多位點(diǎn)串聯(lián)重復(fù)序列分析(VNTR/MLVA)等分子分型方法的應(yīng)用研究進(jìn)展予以綜述。

布魯菌；分子；分型；進(jìn)展

布魯菌是一類胞內(nèi)寄生的革蘭氏陰性菌，是引起人獸共患傳染病布病的病原菌，也是威脅公共安全和健康的潛在生物武器[1]。布魯菌主要宿主為牛、羊、豬、犬等家畜和野生動物，也存在于海洋動物中。動物感染布魯菌主要引起流產(chǎn)；人感染后主要表現(xiàn)為發(fā)熱、乏力、關(guān)節(jié)肌肉疼痛等。慢性患者伴有神經(jīng)系統(tǒng)癥狀及多個功能器官的不同程度的損傷。不僅給流行地區(qū)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失和社會負(fù)擔(dān)，更重要的是危害人類和動物的健康。

多年來，布魯菌的分型鑒定均依靠傳統(tǒng)的方法。但因其周期較長，約有10%～30%的布氏菌成為無法鑒定的非典型菌株[2]、還存在實(shí)驗(yàn)室獲得性感染的風(fēng)險；另外，許多編碼血清的特異性基因是可以水平轉(zhuǎn)移的，即血清型相同的菌株不一定有遺傳相關(guān)性。由于這些問題的存在致使傳統(tǒng)方法難以滿足當(dāng)前布病防控的需要。目前，已有多種分子分型方法被應(yīng)用于布魯菌的快速鑒定和溯源分析，其靈敏度、特異性、分辨力、重復(fù)性等都優(yōu)于傳統(tǒng)方法。不論在布病的分子流行病學(xué)調(diào)查、病原菌的快速分型鑒定、溯源分析、傳播途徑的追查，還是菌株之間差異關(guān)系分析、疫情預(yù)防控制方面都具有十分重要的作用。

1 核酸探針技術(shù)(DNA probes)

核酸探針技術(shù)也叫分子雜交技術(shù)，可定性或定量檢測特異布魯菌DNA序列片段，從而對布魯菌進(jìn)行種型鑒定。Grimont F等[3]用克隆的DNA探針進(jìn)行了布魯菌的分子分型研究。試驗(yàn)表明該方法可對大多數(shù)常見的如羊1、羊3、牛1、牛3、豬2和綿羊附睪種進(jìn)行區(qū)分，并指出這一分型系統(tǒng)較為實(shí)用，并不存在生物安全問題。Fernandez等[4]以流產(chǎn)布魯氏菌16S rRNA序列制備熒光核酸探針進(jìn)行全菌雜交試驗(yàn)。該方法可將豬種布魯氏菌2、3、4、5型和幾乎全部布魯氏菌菌屬區(qū)別開。Nele Wellinghausen等[5]介紹了一種新的熒光原位雜交試驗(yàn)可快速、特異的鑒定所有引起人感染的布魯菌，且該方法能直接用于檢測陽性血培養(yǎng)物中的布魯菌，試驗(yàn)的特異性和敏感性分別為100%，該方法比自動培養(yǎng)系統(tǒng)提前16～38 h檢測到了布魯菌，是一種快速、價格低廉的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，但其在骨髓標(biāo)本和或組織中檢測布魯菌的有效性有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。該方法可直接對臨床樣本中的微生物行檢測，并能區(qū)分致病菌與非致病菌，但分析較為主觀、操作復(fù)雜，質(zhì)控不嚴(yán)格容易產(chǎn)生假陰性和假陽性結(jié)果。

2 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是一種體外DNA擴(kuò)增技術(shù)，該方法有較強(qiáng)的特異性和較高的敏感性，在生物學(xué)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。Baily等[6]首次將PCR方法用于布魯菌的鑒定，該方法可以在屬的水平上鑒定布魯菌。Bricke等[7]建立了AMOS-PCR方法，首次將PCR用于布魯菌的分型。該方法可同時鑒定牛種布魯菌1、2、4型，羊種布魯菌1、2、3型，豬種布魯菌1型以及綿羊附睪種布魯菌。姜海等[8]評價AMOS-PCR方法在鑒定布魯氏菌種型的實(shí)用性。用該方法鑒定了布魯菌標(biāo)準(zhǔn)菌株和地方野毒株。試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了該方法是一種快速、簡便、特異的布魯菌分型鑒定方法之一。劉國棟等[9]描述了一種多重PCR方法可以在同一體系中對布魯菌的6個種進(jìn)行鑒定。試驗(yàn)結(jié)果表明除綿羊附睪種外該方法能將其余5種布魯菌全部鑒定出來。該方法快速、準(zhǔn)確，無生物風(fēng)險，是布魯菌鑒定的輔助方法。目前，這3種方法已經(jīng)成為大多數(shù)試驗(yàn)鑒定布氏菌的常規(guī)方法，在全國各地廣泛使用。

3 16SrDNA鑒定

16SrDNA核苷酸序列存在于所有細(xì)菌的基因組中，既能體現(xiàn)不同菌屬之間的差異，被用于革蘭染色差、生化反應(yīng)不活躍、代謝反應(yīng)和生長模式較為獨(dú)特菌株的分型鑒定；又能用于發(fā)現(xiàn)和描述新的細(xì)菌種類,尤其是適用于表型鑒定難于定型的細(xì)菌[11]。Gee JE等[12]用16SrDNA序列分析法進(jìn)行了布魯菌分離株快速鑒別研究，表明16S rDNA可在屬的水平上鑒別布魯菌，并具有快速、低生物風(fēng)險的優(yōu)點(diǎn)，但不能進(jìn)行種型鑒別。Jonas等[13]指出16S rDNA在大多數(shù)布魯菌中高度保守，可作為種的區(qū)分標(biāo)記，能夠準(zhǔn)確、快速的鑒別布魯菌感染，不需要常規(guī)的診斷方法。湯旭等[14]對16S rDNA序列分析方法在布氏菌鑒定中的應(yīng)用做了分析。指出布魯菌中16S rDNA核苷酸序列相似性達(dá)到了99.74%,而與其他有血清型交叉反應(yīng)的菌株相比較,16S rDNA序列間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明16S rDNA序列分析是一種快速、簡便、特異的鑒定布魯菌的方法。總之，該方法的優(yōu)點(diǎn)在于能對未知樣品和難鑒定的布氏菌進(jìn)行快速種屬分析。但缺點(diǎn)是某些菌種由于種間差異小，單獨(dú)依靠16SrDNA鑒定不能鑒定到種，如布氏菌、人蒼白桿菌等，需要其它鑒定方法輔助；另外，16SrDNA鑒定是基于PCR的鑒定方法，應(yīng)注意做好相應(yīng)的對照[15]。

4 實(shí)時定量PCR(real-time PCR)

實(shí)時熒光定量PCR是在一個反應(yīng)體系內(nèi)將靶基因的擴(kuò)增與探針雜交檢測相結(jié)合的PCR方法，該方法能夠特異、靈敏、快速、并精確定量起始模板濃度，所以被廣泛的應(yīng)用于各種病原菌的檢測鑒定中[16]。Redkar等[17]用該方法對牛種布魯菌的7個型，羊種布魯菌的3個型以及豬種布魯菌1型進(jìn)行了鑒定。指出具有較好的特異性和靈敏度，靈敏度可達(dá)到0.25 pg即相當(dāng)于16-25個基因拷貝，并可在25～30 min完成鑒定，也可在野外或流行現(xiàn)場應(yīng)用。Probert WS等[18]在R.Redkar研究的基礎(chǔ)上建立了一種實(shí)時多重PCR，可同時快速鑒定布魯菌屬、牛種布魯菌和羊種布魯菌。該方法最低可以檢測到150 fg純的布魯菌DNA，具有較高的敏感性和較強(qiáng)的特異性，不僅省時，還可節(jié)省成本、降低勞動強(qiáng)度，更重要的是可以杜絕與布氏菌的接觸。Debeaumont C等[19]對應(yīng)用該方法檢測人血清樣本中布魯菌DNA 進(jìn)行了評價。結(jié)果表明該方法具有較高的特異性和選擇性，并指出該方法適合布魯菌分離培養(yǎng)陰性、血清試驗(yàn)證實(shí)與布魯菌有交叉反應(yīng)的布病病例的確證。Bounaadja L等[20]對用3種實(shí)時PCR鑒定布魯菌的優(yōu)劣進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室評價。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示3種方法均能擴(kuò)增到布魯菌DNA，而最早出現(xiàn)擴(kuò)增信號的是IS711實(shí)時PCR，并指出實(shí)時PCR比常規(guī)PCR敏感，實(shí)時PCR操作簡便、快速并可以降低DNA樣品污染的風(fēng)險。表明該方法是一種特異、敏感、高效、快速、安全的布魯菌鑒定方法。

5 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度多態(tài)性分析技術(shù)(PCR-RFLP)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度多態(tài)性分析結(jié)合了PCR的敏感性和RFLP技術(shù)的特異性，是一種非常有用的通過用限制性內(nèi)切酶對DNA選擇性降解、進(jìn)一步分析PCR產(chǎn)物的工具。不僅提高了目的DNA的含量和相對特異性，還具有分辨率高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，在布魯菌的分型和診斷等方面被廣泛應(yīng)用。Axel Cloeckaert等[21]用該方法進(jìn)行了布魯菌分型研究。結(jié)果顯示該方法可鑒定出布魯菌的各種和型，但是不能區(qū)分犬種和豬種布魯菌3、4型，并指出該方法操作較繁瑣，在實(shí)際應(yīng)用中較困難。崔步云等[22]的研究結(jié)果表明該方法不僅能在屬的水平上檢測、鑒定布魯氏菌屬,而且能夠?qū)?07株國內(nèi)外布魯氏菌的參考菌株和地方流行菌株分為8個組，還可對布魯菌進(jìn)行分型,可用于典型和非典型布魯氏菌的鑒定和分型,可彌補(bǔ)傳統(tǒng)分類方法的不足。Al Dahouk S等[23]的試驗(yàn)表明該方法是一種分辨力強(qiáng)、再現(xiàn)性好、穩(wěn)定性高、并且和流行病學(xué)一致的分型方法。

6 單核苷酸多態(tài)性分析(SNP)

SNP是指基因組DNA序列中由于單個核苷酸的突變而引起的多態(tài)性，是基因組中最常見的多態(tài)性形式，數(shù)量多、分布廣、遺傳穩(wěn)定、易于基因分型，故可用于細(xì)菌的分型鑒定[24]。為了省時和降低生物風(fēng)險，Scott JC等[25]建立了一種多重SNP方法，該試驗(yàn)可以快速、準(zhǔn)確的鑒定6種古典的布魯菌種和海洋布魯菌的各個成員。Foster JT等[26]根據(jù)布魯菌管家基因及其他基因中存在的核苷酸多態(tài)性建立了一種SNP位點(diǎn)實(shí)時熒光PCR，并對338株布魯菌進(jìn)行種型檢測。指出該方法可快速、靈敏的鑒別大多數(shù)布魯菌屬細(xì)菌，可檢測到少于10fg的布魯菌DNA，在臨床和法醫(yī)領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價值。

7 脈沖場凝膠電泳(PFGE)

脈沖場凝膠電泳是將整個細(xì)菌的染色體進(jìn)行限制性酶切，通過產(chǎn)生的DNA圖譜對細(xì)菌進(jìn)行鑒別分型，是鑒別能力最強(qiáng)且理論上適合于所有細(xì)菌的分型鑒定方法，其產(chǎn)生的DNA指紋模式圖是追蹤暴發(fā)來源的最佳工具。Annick AS等[27]用該方法進(jìn)行了布魯菌分型研究。結(jié)果顯示PFGE可以在種的水平上區(qū)分除沙林鼠種布魯菌外的另外5個布魯菌種。崔步云等[28]對分離自我國的不同時間、地點(diǎn)的122株布魯菌進(jìn)行了PFGE分析，結(jié)果顯示牛種、羊種和豬1、3型布魯菌是穩(wěn)定的型別，而其余菌種的相似度較差，但符合布魯菌的分類歷史，即犬種菌可能是牛種菌的轉(zhuǎn)移宿主形成；其他菌株是野生動物體內(nèi)自然界中循環(huán)、保存的菌株，該研究為闡明布魯菌的進(jìn)化提供了分子證據(jù)。該方法穩(wěn)定性好，分辨率高，已成為許多細(xì)菌分型、調(diào)查菌株間遺傳關(guān)系的可靠方法。但PFGE也有局限性，不適宜用于解釋分離菌株的克隆性；另外，在耗時和人力方面，以及對圖譜解釋有較強(qiáng)的主觀性，圖譜的存儲和分析需要專業(yè)的軟件和熟練的技術(shù)人員處理，在一定程度上限制了其推廣使用。

8 多位點(diǎn)序列分型(MLST)

多位點(diǎn)序列分型(MLST)是一種基于管家基因核酸序列測定的細(xì)菌分型方法。該方法既適于分子流行病學(xué)調(diào)查,也可用于細(xì)菌的分子進(jìn)化研究。目前，MLST常被作為國際間菌株比較的有力工具。該方法重復(fù)性好、分辨率高,數(shù)據(jù)可實(shí)現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)共享及標(biāo)準(zhǔn)化比較。為探討布魯菌屬各菌株間的親緣關(guān)系,Whatmore AM等[29]針對布魯菌的7個管家基因和2個非管家基因位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物,對160株布氏菌進(jìn)行MLST分析,試驗(yàn)將160株布氏菌分為27個序列型。種系發(fā)生樹顯示各ST形成的類群與傳統(tǒng)分類基本一致,但ST18(豬種生物3、4型)與ST21(犬種)的親緣關(guān)系更為密切,這點(diǎn)與MLVA-21分型結(jié)果相似,ST19(豬種生物5型)從豬種布魯菌分支中分離出來,ST6(Tulya株)遠(yuǎn)離其他牛種ST,46株海洋哺乳動物分離株分成5個ST型，并可形成一個獨(dú)立種，指出隨著測序技術(shù)發(fā)展和成本降低,MLST將成為布魯菌分型的有力工具。周曉艷等[30]對分離自我國的47株羊種3型布魯氏菌進(jìn)行MLST分析,結(jié)果顯示19株布氏菌的omp25基因與目前已有的等位基因型不同,被定義為1個新的等位基因型，即ST28。其余28株與已知的ST8型的各等位基因型一致，指出國內(nèi)的菌株與國外菌株的遺傳背景上有差異，該方法可作為研究布魯菌進(jìn)化關(guān)系的重要手段。總之，該方法是一種較為客觀、準(zhǔn)確且適合于數(shù)據(jù)庫儲存和軟件分析的基因分型方法，還可用于分子流行病學(xué)研究。

表1 幾種常用布氏菌分型方法對比表

9 多位點(diǎn)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分型(MLVA)

多位點(diǎn)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列(VNTR)在原核與真核生物基因組中廣泛存在,其作為遺傳標(biāo)記的多態(tài)性主要來自于不同數(shù)目的串聯(lián)重復(fù)，串聯(lián)重復(fù)次數(shù)的改變是由細(xì)菌在復(fù)制過程中出現(xiàn)錯配和重組而產(chǎn)生[31]。細(xì)菌在進(jìn)化過程中不斷發(fā)生的VNTR改變使高度同源性的細(xì)菌分型成為可能。Philippe LF等[32]用該方法對布魯菌進(jìn)行了分型研究。通過系列試驗(yàn)最終選出15個VNTR位點(diǎn)，并分為兩組，一組為8個微衛(wèi)星序列，能夠在種的水平上鑒定，另一組為7個小微衛(wèi)星序列，能對布魯菌進(jìn)行更進(jìn)一步的辨析，并對236株布魯菌進(jìn)行了試驗(yàn)。結(jié)果顯示該方法與傳統(tǒng)方法有較高的一致性，能準(zhǔn)確鑒定一些傳統(tǒng)方法難以鑒定的布魯菌。該方法不僅能從基因水平上準(zhǔn)確鑒定布魯菌，并能更加細(xì)微的區(qū)分這些菌株在基因進(jìn)化方面的關(guān)系，并能闡明布病的流行病學(xué)特征。趙鴻雁等[33]根據(jù)其實(shí)驗(yàn)結(jié)果指出該方法是一種分辨率高且易于在省級疾控系統(tǒng)使用的標(biāo)準(zhǔn)化分型方法，此方法可以提高布病的監(jiān)測能力。Minharro S等[34]應(yīng)用MLVA-16分型方法對137株牛種布魯菌進(jìn)行了分型以及菌株分布情況的研究。證實(shí)了巴西境內(nèi)分布的牛種菌主要有牛1、2、和3型，其中3型為3b型；并首次描述了有牛種4型和6型在存在。同時，根據(jù)試驗(yàn)分析揭示了這些菌株之間存在著高度的差異性。該方法將137株牛種菌分成了89個基因型，有些基因型存在地理群集，指出該方法對進(jìn)一步了解牛種菌在巴西的流行病學(xué)有極大的幫助。MLVA方法不僅可用于闡明布魯菌病的流行病學(xué)特征，也可用于傳染源的追溯，而且標(biāo)準(zhǔn)化的MLVA方法還可用于國際間菌株的比較分析。

綜上所述，一種好的分型方法須具備操作簡便、成本低廉、分辨率高、重復(fù)性好、分型能力強(qiáng)、結(jié)果易解釋、易于推廣等特點(diǎn)。但目前未見有何種方法具備這些優(yōu)點(diǎn)。而相對于傳統(tǒng)的布魯菌分型方法，分子分型方法有極大的飛躍。不僅可以快速、準(zhǔn)確、低生物風(fēng)險的對布氏菌進(jìn)行分型鑒定；還可以開展遺傳進(jìn)化、追蹤溯源、分子流行病學(xué)等多種研究。另外，分子方法能夠建立數(shù)據(jù)庫，在全世界范圍內(nèi)進(jìn)行參比，能進(jìn)一步深化人類對布魯菌致病、感染機(jī)制以及微進(jìn)化方面的認(rèn)識，可有效的提升人類防控布病的水平。但因每一種分子分型方法的原理和側(cè)重不同，為我們提供的分子信息也不盡相同。在布病防控形勢依然嚴(yán)峻的當(dāng)前，還未見有哪一種分子分型方法被布魯菌分類學(xué)委員會所采用，并能夠取代傳統(tǒng)的布魯菌分型方法。為此，我們建議，在進(jìn)行布魯菌的分型鑒定時，應(yīng)因地制宜、結(jié)合實(shí)際，應(yīng)多法并用，相互參考，盡可能多的提供相關(guān)的信息，為布病預(yù)防和控制提供科學(xué)的理論依據(jù)。

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Application of molecular method forBrucellatyping

LIU Zhi-guo1,2,3,CUI Bu-yun4,LIU Ri-hong3,WANG Miao3,JIE Xin-xia3,LI Xiao-lin3,XIA Xian-zhu1,5

(1.CollegeofVeterinaryMedicine,InnerMongoliaAgricultureUniversity,Hohhot01008,China;2.UlanqabCenterforEndemicDiseaseControl,Ulanqab012000,China;3.UlanqabBureauforHealth,Ulanqab012000,China;4.NationalInstituteofInfectiousDiseasesControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing102206,China;5.InstituteofMilitaryVeterinaryAMMS,Changchun130062,China)

Brucellaspp. are pathogenic bacteria of brucellosis. At present, there are many methods forBrucellatyping. However, molecular typing methods are used in wide range and play a very important role, especially in molecular epidemiological investigation, rapid identification, typing & tracing analysis, and variation analysis among strains of brucellosis. In the paper, we summarize the common use of molecular typing method in the typing ofBrucellaspp. These ways involve DNA probes, PCR, real-time PCR, PCR-RFLP, PFGE, 16SrDNA, SNP, MLST, and MLVA.

Brucella; molecular; typing; overview

s: Xia Xian-zhu, Email:xiaxzh@cae.cn; Cui Bu-yun, Email: cuibuyun@icdc.cn

夏咸柱, Email: xiaxzh@cae.cn； 崔步云, Email: cuibuyun@icdc.cn

1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，呼和浩特 010018； 2.烏蘭察布市衛(wèi)生局，烏蘭察布 012000； 3.烏蘭察布市地方病防治中心，烏蘭察布 012000； 4.中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所，北京 102206； 5.中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所,長春 130122

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.02.015

R374

A

1002-2694(2015)02-0163-06

2014-06-10；

2014-10-22

內(nèi)蒙古衛(wèi)計(jì)委醫(yī)療衛(wèi)生科研項(xiàng)目(No.201301094)資助

Funded by the Medicine and Health Research Project from Health and Family Planning Commission of the Inner Mongolia, China (No. 201301094)