寧 天，黃維真，李軍芳，張 清，梁 紅，樂 寧，趙小杰，寧小清

(1. 廣西衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530023；2. 廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院/廣西婦產(chǎn)醫(yī)院，廣西 南寧 530003；3. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，廣西 南寧 530001)

壯藥白花九里明提取物對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌體外抗菌作用研究

寧 天1，黃維真2，李軍芳3，張 清2，梁 紅1，樂 寧3，趙小杰3，寧小清3

(1. 廣西衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530023；2. 廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院/廣西婦產(chǎn)醫(yī)院，廣西 南寧 530003；3. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，廣西 南寧 530001)

目的 研究壯藥白花九里明水、醇提取物對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)體外抗菌的作用，為臨床治療MRSA感染提供新的途徑。方法 制備壯藥白花九里明水、醇提取物，采用紙片擴(kuò)散法對(duì)臨床分離的MRSA菌株進(jìn)行體外抑菌實(shí)驗(yàn)，肉湯稀釋法測(cè)定最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)。結(jié)果 壯藥白花九里明的水提取物抑菌圈直徑為18～24 mm，醇提取物抑菌圈直徑為11～18 mm；水提取物的MIC為31.25～250 mg/mL、MBC為31.25～250 mg/mL，醇提取物的MIC為31.25～250 mg/mL、MBC為62.5～500 mg/mL。結(jié)論 壯藥白花九里明水、醇提取物對(duì)MRSA菌株有較好的抑制作用。

白花九里明；耐甲氧西林金黃色葡萄球菌；最小抑菌濃度；最小殺菌濃度；體外抗菌

隨著抗菌藥物的廣泛應(yīng)用和濫用，很多細(xì)菌產(chǎn)生了耐藥性，尤其是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)的感染問題日益嚴(yán)重，單純使用抗生素已經(jīng)不能滿足臨床的需要。從純天然民族藥中尋找抗菌成分為新抗菌藥研發(fā)提供了新的途徑，其來(lái)源廣、價(jià)格低廉且不良反應(yīng)少的特點(diǎn)也顯示了具有進(jìn)一步開發(fā)的優(yōu)勢(shì)，因此，從純天然民族藥物中找尋抗微生物感染的新藥越來(lái)越受到關(guān)注[1-4]。壯藥白花九里明來(lái)源于菊科艾納香屬植物東風(fēng)草[Blumea megacephala (Randeria) Chang et Tseng]干燥全草，本研究觀察了壯藥白花九里明水、醇提物對(duì)MRSA的體外抗菌作用，為進(jìn)一步對(duì)壯藥白花九里明的新藥開發(fā)及臨床應(yīng)用和相關(guān)研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)資料

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)菌 MRSA來(lái)自廣西婦幼保健院、廣西民族醫(yī)院微生物室2012年11月—2013年10月臨床分離鑒定菌株，根據(jù)菌株保存時(shí)間按隨機(jī)數(shù)字法抽取8株MRSA為實(shí)驗(yàn)菌。

1.1.2試劑 Mueller-Hinton 肉湯培養(yǎng)基(MHB)、Mueller-Hinton瓊脂培養(yǎng)基(MH)，均為杭州天和生物技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)。抗生素藥敏紙片，英國(guó)奧賽公司生產(chǎn)。

1.1.3植物原材料 壯藥白花九里明采自廣西南寧市郊區(qū)，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)寧小清高級(jí)實(shí)驗(yàn)師鑒定為菊科植物東風(fēng)草Blumea megacephala(Randeria) Chang et Tseng的地上部分。

1.1.4壯藥白花九里明水提取液的制備 取陰干藥材剪碎，加水過面浸泡30 min后，煎煮3次，每次1 h，過濾后合并3次濾液，濃縮至水煎液濃度為3 g/mL，取3 g/mL水提取液20 mL稀釋為1 g/mL，備用。

1.1.5壯藥白花九里明醇提取液的制備 取陰干藥材剪碎，加80%乙醇回流提取，反復(fù)2次，每次1 h，過濾后合并濾液，濃縮至濃度為3 g/mL，取3 g/mL醇提取液20 mL稀釋為1 g/mL，備用。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1菌液的制備 所有的實(shí)驗(yàn)菌用哥倫比亞血瓊脂平板于35 ℃下培養(yǎng)18～24 h，生長(zhǎng)菌落用無(wú)菌生理鹽水分別稀釋成1.5×108CFU/mL( 0.5麥?zhǔn)蠁挝?、1×107CFU/mL、1×103CFU/mL，備用。

1.2.2含藥紙片的制備 分別取20 μL濃度為3 g/mL白花九里明水、醇提取物加入到直徑6 mm無(wú)菌紙片中，備用。紙片含藥量為0.06 g。

1.2.3抑菌圈的測(cè)定 采用紙片擴(kuò)散法[5]用無(wú)菌棉拭蘸取0.5麥?zhǔn)蠁挝桓鲗?shí)驗(yàn)菌菌液，在試管壁上擠壓幾次壓去多余菌液，均勻涂布接種于整個(gè)MH平板。將含藥紙片貼于已接種實(shí)驗(yàn)菌的MH平板上,輕壓紙片使其貼平,直徑90 mm平皿等距離貼6張紙片。氨曲南(30 μg/紙片)作耐藥對(duì)照，利奈唑胺(30 μg/紙片)作敏感對(duì)照。放置于35 ℃恒溫箱培養(yǎng)24 h后,取出用游標(biāo)卡尺測(cè)量各抑菌圈的直徑。

1.2.4最小抑菌濃度(MIC)的測(cè)定[5-6]采用肉湯稀釋法進(jìn)行。肉湯稀釋法中藥提取液由于顏色太深, 難于直觀判定，因此在1 000 mL MHB 中加入3 g葡萄糖、0.4%酚紅溶液6 mL做指示劑，成為葡萄糖酚紅MHB。取160支滅菌帶膠塞試管,每10支為一組編號(hào)，每支試管內(nèi)(除每排第一管外)分別加入葡萄糖酚紅MHB 2.0 mL。每排第1、第2管分別加入1 g/mL壯藥白花九里明水提、醇提藥液2.0 mL,藥液從第2管起做二倍遞減濃度稀釋(即1～8號(hào)試管內(nèi)藥物濃度依次為1.0，0.5，0.25，0.125，0.062 5，0.031 5，0.016，0.008 g/mL) 。在1～8號(hào)試管每管分別加入1×107CFU/mL菌液0.1 mL,第9號(hào)試管加壯藥白花九里明水提或醇提藥液2 mL,不加菌液,作為對(duì)照,觀察藥物是否污染,第10號(hào)試管加葡萄糖酚紅MHB 2.0 mL和1×107CFU/mL菌液0.1 mL,作為細(xì)菌對(duì)照,觀察細(xì)菌是否正常生長(zhǎng)。然后將實(shí)驗(yàn)管和對(duì)照管置35 ℃培養(yǎng)18～24 h后取出, 觀察并判定藥物對(duì)各菌株的MIC。

1.2.6MRSA菌株鑒定 采用Vitek2Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀進(jìn)行細(xì)菌鑒定及藥敏試驗(yàn)，藥敏結(jié)果根據(jù)2012美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(CLSI)標(biāo)準(zhǔn)[7]判斷。以苯唑西林MIC≥4判定為MRSA。

2 結(jié) 果

2.1抑菌圈測(cè)定結(jié)果 根據(jù)《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》[8]標(biāo)準(zhǔn)判定，抑菌圈直徑<10 mm為抗藥，10 mm為輕度敏感，11～15 mm為中度敏感，>16 mm為高度敏感。壯藥白花九里明水提取物抑菌圈直徑18～24 mm，醇提取物抑菌圈直徑11～18 mm。醇提物對(duì)MRSA有中度抑菌作用，水提取物對(duì)MRSA有強(qiáng)抑菌作用。各菌株抑菌圈測(cè)定結(jié)果見表1。

表1 壯藥白花九里明提取物對(duì)MRSA的抑菌圈直徑 mm

2.2MIC、BC測(cè)定結(jié)果 壯藥白花九里明提取物具有體外抗菌活性，水提取物對(duì)MRSA的MIC為31.25～250 mg/mL 、MBC為31.25～250 mg/mL，醇提取物對(duì)MRSA的MIC為31.25～250 mg/mL、MBC為62.5～500 mg/mL。見表2。

3 討 論

人類很多嚴(yán)重的細(xì)菌感染性疾病使用了抗菌藥物而得到有效的控制。但是,因?yàn)榭咕幬锸褂玫牟缓侠韺?dǎo)致了耐藥菌株的增加,大大降低了現(xiàn)有抗菌藥物的治療效果,嚴(yán)重地威脅著人類的健康。2012年中國(guó)CHMET細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)結(jié)果表明，MRSA耐藥率為47.9%，根據(jù)CLISL解釋標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)具有抗MRSA活性的內(nèi)酰胺酶類藥物試驗(yàn)結(jié)果報(bào)告耐藥的MRSA嚴(yán)重感染可采用萬(wàn)古霉素，但由于萬(wàn)古霉素對(duì)肝腎功能的損害大而影響治療的選擇。如何延緩耐藥菌株的生成、避免不良反應(yīng)以及研究新的抗菌藥物已成為21世紀(jì)醫(yī)藥學(xué)界重要的課題。醫(yī)藥學(xué)家在努力開發(fā)抗菌譜更廣、作用更強(qiáng)和不良反應(yīng)更少的新抗菌藥物,可越來(lái)越多的證據(jù)表明，細(xì)菌產(chǎn)生耐藥的速度已超過新藥研發(fā)的速度,一般新的抗菌藥物從研發(fā)到上市的周期長(zhǎng)達(dá)10年，而細(xì)菌產(chǎn)生耐藥的時(shí)間僅要2年，何況研制一個(gè)新抗菌藥物的成本非常大。幾千年來(lái)中藥為中國(guó)人民的健康作出了重大貢獻(xiàn),在現(xiàn)代防控細(xì)菌性感染疾病等方面都發(fā)揮了積極的作用。由于中藥包括民族藥的特殊性,細(xì)菌較少對(duì)其產(chǎn)生耐藥性，而且其來(lái)源廣、費(fèi)用低廉、不良反應(yīng)少。因此,研究和開發(fā)抗菌中華傳統(tǒng)民族藥對(duì)解決耐藥菌株的產(chǎn)生和抗菌藥物短缺和避免嚴(yán)重不良反應(yīng)等問題都具有非常重要的意義。

表2 壯藥白花九里明提取物對(duì)MRSA的MIC、MBC mg/mL

本次實(shí)驗(yàn)所用MRSA都是從臨床感染患者中分離的對(duì)抗生素有不同程度耐藥的菌株，對(duì)長(zhǎng)期大量使用抗菌藥和久治不愈的重癥感染患者具有很大的威脅，而本次實(shí)驗(yàn)壯藥白花九里明水、醇提取物對(duì)MRSA臨床菌株表現(xiàn)出較好的體外抗菌作用，該結(jié)果為壯藥白花九里明抗菌作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù),為合理使用壯藥白花九里明奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。壯藥白花九里明水、醇提取物對(duì)MRSA抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，水提取物抗菌作用強(qiáng)于醇提取物，說明壯藥白花九里明對(duì)MRSA抑菌成分存在于水溶性部分，具體活性成分分析、分離、提純還有待于進(jìn)一步研究。

壯藥白花九里明廣泛分布于廣西、云南、四川、貴州、廣東、湖南南部、江西南部、福建及臺(tái)灣等省區(qū)[9]，是廣西民間常用藥材，味苦、微辛，性涼，具有清熱明目、祛風(fēng)止癢、解毒消腫作用。主治目赤腫痛，翳膜遮睛，風(fēng)疹、疥瘡、皮膚瘙癢、癰腫瘡癤、跌打紅腫等[10]。還具有清熱解毒功效，可治療產(chǎn)后出血和繼發(fā)細(xì)菌感染[11]等癥，與抗菌作用實(shí)驗(yàn)是吻合的。治療感染性疾病方面單味中藥也發(fā)揮了重要作用。蘇鏡如等[12]對(duì)廣西梧州產(chǎn)廣藿香全草中的精油成分及其抗菌活性進(jìn)行了研究,結(jié)果表明,廣藿香精油對(duì)新型隱球菌、球毛殼菌和短柄帚菌的生長(zhǎng)抑制比較顯著，對(duì)白葡萄球菌、枯草桿菌、四聯(lián)球菌、金黃色葡萄球菌也有一定的抑制作用。有的中藥除自身具有抗菌作用外,在與某些抗菌藥物合用時(shí)還可起到協(xié)同作用。雙黃連粉針是由金銀花、黃芩、連翹等制成的天然藥物注射劑,具有抗病毒及抗菌作用,臨床常用于治療肺炎、上呼吸道感染等多種疾病,常分別與多種抗生素配伍使用。實(shí)驗(yàn)觀察了該藥與青霉素G,頭孢唑啉,頭孢噻肟鈉,妥布霉素伍用時(shí)體外抗菌作用、細(xì)菌清除率和比較肺炎病人單用及合用時(shí)體內(nèi)血藥濃度與臨床療效的相關(guān)性,結(jié)果雙黃連粉針與這四種抗生素伍用具有較好的安全性,可顯著增強(qiáng)抗感染的效果,與單用以上抗生素比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,體內(nèi)外結(jié)果相似[13]。

篩選出活性較好的純天然民族藥進(jìn)一步分離提純并與抗菌藥物聯(lián)合，進(jìn)行體外、體內(nèi)抗菌實(shí)驗(yàn)，選擇有協(xié)同作用的抗菌藥物開發(fā)并在臨床使用，可以達(dá)到更好的治療效果。本研究只測(cè)定壯藥白花九里明對(duì)MRSA的體外抗菌作用,而這一抗耐藥菌作用明顯，用途廣泛，分布廣闊的植物資源，對(duì)其他菌和多重耐藥菌的體外、體內(nèi)作用、有效成分和作用機(jī)制、急性毒性等非常值得進(jìn)一步深入研究和開發(fā)。

[1] 宋世平，解曉珍，席道友，等. 158株金黃色葡萄球菌的耐藥性監(jiān)測(cè)與分析[J]. 中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2003，13(4):384-385

[2] Rice L. Antimicrobial resistance in gram positive bacteria[J]. Am J Infect Control，2006，34(5 Suppl1):S11-19;discussion S64-S73

[3] Dreww RH，Perfect K，Smith L，et al. Treatment of methicillin resistant Staphylococcus aureus infections with quinupristin/dalfopritin in patients intolerant or failing prior therapy[J]. Antimicrob Chemother，2000，46(3):775-778

[4] 李娟,李曉東,楊麗霞,等. 單味中藥體外抑菌活性的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2011,17(11):283-286

[5] 周庭銀. 臨床微生物診斷與圖解[M]. 上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2007：34-37

[6] 馮秀麗,許慶華，趙曉云,等. 金銀花及其復(fù)方的體外抑菌活性與體內(nèi)抗炎作用[J]. 沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào),2013,30(1):35-39

[7] Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing[M]. Twenty-second informational supplement．CLSI，Wayne，PA,2012：M100-S22

[8] 徐叔云，卞如濂，陳修. 藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M]. 3版. 北京: 人民衛(wèi)生出版社，2002:1647-1653

[9] 中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編輯委員會(huì). 中國(guó)植物志[M]. 北京：科學(xué)出版社， 1979：11

[10] 國(guó)家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會(huì). 中華本草[M]. 上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1998：743

[11] 方鼎. 壯族民間用藥選編[M]. 南寧：廣西民族出版社，1985：74-75

[12] 蘇鏡如,張廣文,李核,等. 廣藿香精油化學(xué)成分分析與抗菌活性研究(I)[J]. 中草藥,2007,32(3):2041

[13] 林彬,李仲昆,黃惠珍,等. 黃連粉針與4種抗生素的伍用[J]. 中國(guó)藥房,2000,9(4):1711

Study on the antibacterial effect in vitro of against methicillin-resistant Staphylococcus aureus of extractive Blumea megacephala (Randeria) chamg et Tseng

NING Tian1, HUANG Weizhen2, LI Junfang3, ZHANG Qing2, LIANG Hong1, LE Ning3, ZHAO Xiaojie3, NING Xiaoqing3

(1.Guangxi Health Vocational & Technical College, Nanning 530023, Guangxi, China; 2.Guangxi Maternal and Child Health Hospital/Guangxi Maternity Hospital, Nanning 530003, Guangxi, China; 3.College of Pharmacy of Guangxi University of TCM,Nanning 530001, Guangxi, China)

Objective It is to explore the antibacterial effect of water, alcohol extract of extractive Blumea megacephala (Randeria) chamg et Tseng against methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in vi-tro, thus to provide a new way for the clinical treatment of MRSA infection. Methods Water, alcoholextraction of Blumea megacephala (Randeria) chamg et Tseng was prepared, ant-ibacterial experiment in vitro against Strains of methicillin-resistant Staphylococcus a-ureus isolated from clinic was performed on by the conventional agar diffusion method, minimum inhibitory conc-entration (MIC) and minimal bactericidal concentration (MBC) were determined by double dilution method. Results Bacteriostatic circle diameter of water extract of Blumea megacephala (Randeria) chamg et Tseng was 18-24 mm, and that of alcohol extract was 11-18 mm, MIC of water extract was 31.25-250 mg/mL, MBC was 31.25-250 mg/mL, MIC of alcohol extract was 31.25-250 mg/mL, its MBC was 62.5-500 mg/mL. Conclusion Water, alcohol extract of Blumea megacephala (Randeria) chamg et Tseng have good inhibitory effect against methicillin-resistant Staphylococcus aureus strains.

Blumeu megucephala(Randeria) chamg et Tseng; MRSA; MIC; MBC; antibacterial experiment in vitro

寧天，男，教授，在職研究生，主要從事藥理學(xué)教學(xué)與科研工作。

寧小清，E-mail：1043304247@qq.com

廣西衛(wèi)生廳自籌經(jīng)費(fèi)科研課題(Z2013151)

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.05.002

R961

A

1008-8849(2015)05-0460-03

2014-07-30