楊 炯，李新宇

(1. 解放軍第12醫(yī)院，新疆 疏勒 844200；2. 蘭州軍區(qū)烏魯木齊總醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830000)

膿毒癥大鼠血清miR-9的表達(dá)及其意義

楊 炯1，李新宇2

(1. 解放軍第12醫(yī)院，新疆 疏勒 844200；2. 蘭州軍區(qū)烏魯木齊總醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830000)

目的 探討檢測膿毒癥大鼠血清中miR-9的表達(dá)及其意義。方法 將54只大鼠分為假手術(shù)組24只、膿毒癥組24只和正常對照組6只。建立盲腸結(jié)扎穿孔膿毒癥動(dòng)物模型。檢測各組大鼠血清中白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)和C反應(yīng)蛋白(CRP)濃度水平，評估膿毒癥炎癥反應(yīng)情況；實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法檢測大鼠血清中miR-9的表達(dá)情況；皮爾森相關(guān)分析評估血清miR-9的表達(dá)與IL-6、TNF-α和CRP之間的關(guān)系。結(jié)果 膿毒癥大鼠血清miR-9的表達(dá)水平較正常對照組和假手術(shù)組顯著升高(P均<0.01)，術(shù)后2 h血清miR-9表達(dá)即迅速上升達(dá)到一個(gè)較高水平。皮爾森相關(guān)分析結(jié)果也顯示血清miR-9的表達(dá)與IL-6、TNF-α和CRP呈正相關(guān)(P均<0.01)。結(jié)論 膿毒癥大鼠血清miR-9表達(dá)顯著增高，其水平反映機(jī)體炎癥反應(yīng)狀態(tài)，可以作為膿毒癥早期診斷及預(yù)后的指標(biāo)。

膿毒癥；血清miR-9；白細(xì)胞介素-6；腫瘤壞死因子α；C反應(yīng)蛋白

膿毒癥是嚴(yán)重創(chuàng)傷、感染及大手術(shù)后常見的并發(fā)癥，可引起膿毒癥休克及多臟器功能障礙綜合征(MODS)，是臨床危重病癥最常見的死亡原因[1]。早期診斷膿毒癥，準(zhǔn)確地評價(jià)其病情嚴(yán)重程度和判斷預(yù)后，及時(shí)有效地干預(yù)治療，是降低膿毒癥患者病死率的關(guān)鍵。miRNA是近年來發(fā)現(xiàn)的一類廣泛存在于真核生物中的非編碼調(diào)控單鏈小分子RNA，它通過與其目標(biāo)mRNA分子的3’端非編碼區(qū)域(3’-untranslated region，3’UTR)完全或不完全互補(bǔ)匹配，降解靶標(biāo)基因mRNA或抑制其翻譯[2]。最近的研究結(jié)果顯示miR-9在炎性刺激的白細(xì)胞表達(dá)升高，提示miR-9基因的表達(dá)與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[3]。由于miRNA在血清中穩(wěn)定表達(dá)，且其表達(dá)譜在疾病狀態(tài)下出現(xiàn)異常改變，可能成為潛在的疾病檢測評估指標(biāo)及治療靶點(diǎn)[4-5]。故本研究采用盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)(CLP)制備大鼠膿毒平模型，檢測膿毒癥大鼠血清miR-9表達(dá)改變情況，探討其在膿毒癥中的意義。

1 實(shí)驗(yàn)資料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 清潔級雄性Sprague Dawley(SD)大鼠54只，體質(zhì)量200～250 g，購于新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為假手術(shù)組24只，大鼠麻醉后僅行開腹手術(shù)，不行模型誘導(dǎo)；膿毒癥組24只，大鼠麻醉后行盲腸結(jié)扎穿刺術(shù)建立模型；正常對照組6只，大鼠正常飼養(yǎng)，不做任何處理。其中假手術(shù)組和膿毒癥組按術(shù)后2 h、6 h、12 h、24 h分為4個(gè)亞組，每組6只。

1.2大鼠膿毒癥模型的建立 大鼠術(shù)前禁食12 h、禁水4 h。0.3%戊巴比妥鈉(1 mL/100 g)腹腔注射麻醉后，仰臥于固定臺，腹部備皮消毒。于腹正中線行約2 cm的縱向切口，充分暴露盲腸，在盲腸末端距離回盲瓣約5 mm處用3-0絲線結(jié)扎。然后用18號針頭在結(jié)扎處與盲腸末端的1/2處制造貫通穿孔3個(gè)，輕輕擠壓盲腸使少量盲腸內(nèi)容物溢出形成盲腸漏。原位回納盲腸，3-0絲線雙層縫合關(guān)腹。假手術(shù)組在剖腹后暴露并翻動(dòng)盲腸，但不進(jìn)行結(jié)扎和穿刺。各組術(shù)后均按5 mL/100 g體質(zhì)量皮下注射生理鹽水補(bǔ)充手術(shù)過程中的液體流失。

1.3大鼠血清的收集 將各組大鼠麻醉后仰臥于固定臺。開腹后用10 mL注射器抽取下腔靜脈血6～8 mL，分別置入2 mL微量離心管，室溫下靜置1 h，然后2 000 r/min離心15 min，取上清(血清)置于新1.5 mL微量離心管。將收集的血清樣本置于-80 ℃冰箱保存待檢測。

1.4血清白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、C反應(yīng)蛋白(CRP)的檢測 大鼠IL-6、TNF-α、CRP酶聯(lián)免疫分析試劑盒由上海信然生物技術(shù)有限公司提供，實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按試劑盒說明進(jìn)行操作。

1.5血清miR-9的檢測 采用Real time RT-PCR法檢測miR-9在各組大鼠血清中的表達(dá)情況。①總RNA的提取。Trizol法提取血清和組織總RNA。Nanodrop測定RNA濃度并評估純度，變性瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA純度及完整性。②miRNA的cDNA合成。制備20 μL RT混合反應(yīng)液：Total RNA 0.3 μg，dNTP(2.5 mmol/L each)2 μL，10×RT Buffer 2 μL，RT特異引物(1 μmol/L)0.5 μL，MMLV反轉(zhuǎn)錄酶(10 IU/μL)2 μL，RNA酶抑制劑(40 IU/μL)0.3 μL。在Gene Amp PCR System 9700進(jìn)行RT反應(yīng)：16 ℃，30 min；42 ℃水浴，40 min；85 ℃水浴，5 min反應(yīng)結(jié)束后，冰上冷卻5 min，-80 ℃保存。③miR-9及U6引物序列購于上海英駿生物技術(shù)有限公司，采用stem-loop進(jìn)行miRNA逆轉(zhuǎn)錄。采用10 μL的反應(yīng)體系：dNTP(2.5 mmol/L each)1.0 μL，10×PCR緩沖液1.0 μL，MgCl2溶液0.6 μL，Taq聚合酶0.5 IU，Sybergreen I終濃度0.25×，10 μmol/L的PCR特異引物F 0.4 μL，10 μmol/L的PCR特異引物R 0.4 μL，2×ROX Reference Dye 0.2 μL。反應(yīng)條件：95 ℃，3 min；40個(gè)PCR循環(huán)(95 ℃，15 s；60 ℃，30 s；70 ℃，30 s)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。以U6 snRNA作為內(nèi)參，數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCT法進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠血清IL-6、TNF-α、CRP水平比較 膿毒癥組大鼠血清IL-6、TNF-α和CRP濃度在術(shù)后2h即出現(xiàn)明顯升高，這種變化在術(shù)后6h迅速增大并達(dá)到一個(gè)較高的水平，此后各時(shí)間點(diǎn)IL-6、TNF-α和CRP濃度變化不大。膿毒癥大鼠組各時(shí)間點(diǎn)IL-6、TNF-α、CRP水平與假手術(shù)組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血清IL-6、TNF-α和CRP水平比較

注：①與假手術(shù)組比較，P<0.05；②與本組術(shù)后2h比較，P<0.05。

2.2各組大鼠血清miR-9表達(dá)情況 正常情況下大鼠血清miR-9維持在一個(gè)比較低的水平。膿毒癥組大鼠血清miR-9表達(dá)水平較正常對照組和假手術(shù)組顯著升高(P均<0.01)，術(shù)后2h血清miR-9表達(dá)即迅速上升達(dá)到一個(gè)較高水平，此后變化幅度減小呈緩慢升高趨勢。見圖1。

圖1 不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠血清miR-9表達(dá)情況

2.3血清miR-9與IL-6、TNF-α、CRP的相關(guān)分析 皮爾森相關(guān)分析結(jié)果顯示，血清miR-9與IL-6、TNF-α、CRP的表達(dá)呈明顯正相關(guān)(r=0.700 9，0.745 7，0.726 3，P均<0.01)。見圖2～4。

圖2 血清miR-9與IL-6的相關(guān)性分析

3 討 論

膿毒癥是嚴(yán)重感染導(dǎo)致炎癥反應(yīng)失控的紊亂狀態(tài)，包括一系列的神經(jīng)內(nèi)分泌學(xué)、免疫學(xué)和血液學(xué)反應(yīng)。目前對于膿毒癥尚缺乏確切的治療手段，患者往往死于過度炎癥反應(yīng)所致的組織器官損傷和臟器衰竭。因此，對感染和膿毒癥及其并發(fā)癥進(jìn)行早期診斷和治療顯得尤為重要。近年來發(fā)現(xiàn)miRNA可通過轉(zhuǎn)錄后水平下調(diào)炎癥因子和炎癥因子信號通路的受體來調(diào)控失衡的炎癥反應(yīng)，提示miRNA在膿毒癥炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)控中起到非常重要的作用。更值得關(guān)注的是，膿毒癥患者血清中miRNA的表達(dá)也與正常人不同。

圖3 血清miR-9與TNF-α的相關(guān)性分析

圖4 血清miR-9與CRP的相關(guān)性分析

Vasilencu等[6]應(yīng)用miRNA芯片檢測技術(shù)對比研究了膿毒癥患者和正常人血清中的miRNA表達(dá)譜差異情況，結(jié)果顯示miR-150、miR-182、miR-342-5p和miR-486在2組中差異表達(dá)，并且miR-150表達(dá)水平同SOFA評分相關(guān)，提示miR-150能有效評估膿毒癥患者病情的嚴(yán)重程度；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)TNF-α、IL-10和IL-18可能為miR-150的下游靶基因。Wang等[7]研究顯示，miR-146a和miR-223在膿毒癥患者血清中表達(dá)減少，其中miR-146a和miR-223顯示很高的膿毒癥預(yù)測價(jià)值，具有很高的特異性和敏感性，提示這2種miRNA可以作為膿毒癥患者的血清標(biāo)志物。因此，miRNA可能是一個(gè)理想的基于血液的膿毒癥檢測評估指標(biāo)及治療靶點(diǎn)。

最近的研究數(shù)據(jù)表明，miR-9參與體內(nèi)多種生理病理過程。Bazzoni等[8]的研究顯示，經(jīng)LPS誘導(dǎo)后，人血液循環(huán)中多形核中心粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的miR-9表達(dá)水平會明顯升高，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)這種改變與TLR4的活化有關(guān)。此外，研究還發(fā)現(xiàn)TLR2和TLR7/8激動(dòng)劑以及促炎細(xì)胞因子TNF-α和IL-1β能夠刺激炎癥反應(yīng)細(xì)胞miR-9的表達(dá)，而通過TLR4活化的NF-κB能迅速升高miR-9來細(xì)調(diào)NF-κB家族的一個(gè)關(guān)鍵分子的表達(dá)，從而反饋調(diào)節(jié)NF-κB從屬反應(yīng)。此外，Zhang等[9]研究發(fā)現(xiàn)部分肝切除后大鼠血清中miRNA的表達(dá)出現(xiàn)顯著升高，且發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞分泌是腹部創(chuàng)傷后早期血清中miR-9的主要來源，提示血清中miRNA-9可能參與調(diào)控創(chuàng)傷后炎癥反應(yīng)。以上研究數(shù)據(jù)顯示miR-9在天然免疫應(yīng)答中起非常重要的作用，能夠調(diào)控炎癥反應(yīng)。因此，可以認(rèn)為miR-9可成為膿毒癥診斷的血清標(biāo)記物和治療的潛在靶點(diǎn)。

本研究顯示，膿毒癥組大鼠血清miR-9表達(dá)水平較正常對照組和假手術(shù)組顯著升高，且術(shù)后2h血清miR-9表達(dá)即迅速上升達(dá)到一個(gè)較高水平并呈繼續(xù)升高趨勢。假手術(shù)組miR-9的水平也較正常組升高，但變化幅度遠(yuǎn)小于膿毒癥組。提示血清miR-9可以用于膿毒癥的鑒別診斷。為了進(jìn)一步驗(yàn)證血清miR-9在膿毒癥鑒別診斷中的作用，同時(shí)檢測了實(shí)驗(yàn)大鼠血清IL-6、TNF-α和CRP的濃度水平。IL-6、TNF-α和CRP在機(jī)體的炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮重要作用。正常情況下，血液循環(huán)中IL-6、TNF-α和CRP的濃度很低，炎癥反應(yīng)中IL-6、TNF-α、CRP的濃度可出現(xiàn)明顯改變，三者的表達(dá)水平與病情程度相關(guān)，其生成情況能反映炎癥損傷的嚴(yán)重程度[10-12]。本實(shí)驗(yàn)中膿毒癥大鼠血清IL-6、TNF-α和CRP濃度較正常對照組和假手術(shù)組顯著升高，這種變化在術(shù)后6h迅速增大并達(dá)到一個(gè)較高的水平，此后各時(shí)間點(diǎn)IL-6、TNF-α和CRP濃度變化不大。皮爾森相關(guān)分析結(jié)果顯示血清miR-9的表達(dá)與IL-6、TNF-α和CRP呈明顯正相關(guān)。表明血清miR-9與IL-6、TNF-α和CRP一樣具有評估早期膿毒癥的能力。

總之，本實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)了血清miR-9具有診斷和鑒別膿毒癥的價(jià)值。但是，將miR-9作為臨床膿毒癥患者病情嚴(yán)重程度及預(yù)后的指標(biāo)，還需要大量的基礎(chǔ)和臨床試驗(yàn)來進(jìn)一步驗(yàn)證。此外，由于miR-9在機(jī)體的炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)過程中的重要作用，也可以通過anti-miRNA寡核苷酸(AMOs)、miRNA海綿、miRNA模擬物(miRNAmimics)等途徑調(diào)控體內(nèi)miR-9的表達(dá)，可能成為一種治療膿毒癥的新途徑[13-14]。

[1]TillotsonGS.Introduction:sepsis[J].Chest,2009,136(5Suppl):e28

[2]FabianMR,SonenbergN,FilipowiczW.RegulationofmRNAtranslationandstabilitybymicroRNAs[J].AnnuRevBiochem,2010,79:351-379

[3]TsitsiouE,LindsayMA.microRNAsandtheimmuneresponse[J].CurrOpinPharmacol,2009,9(4):514-520

[4]ChenX,BaY,MaL,etal.CharacterizationofmicroRNAsinserum:anovelclassofbiomarkersfordiagnosisofcancerandotherdiseases[J].CellRes,2008,18(10):997-1006

[5]BlondalT,JensbyNS,BakerA,etal.AssessingsampleandmiRNAprofilequalityinserumandplasmaorotherbiofluids[J].Methods,2013,59(1):S1-S6

[6]VasilescuC,RossiS,ShimizuM,etal.MicroRNAfingerprintsidentifymiR-150asaplasmaprognosticmarkerinpatientswithsepsis[J].PLoSOne,2009,4(10):e7405[7] Wang JF,Yu ML,Yu G,et al. Serum miR-146a and miR-223 as potential new biomarkers for sepsis[J]. Biochem Biophys Res Commun,2010,394(1):184-188

[8] Bazzoni F,Rossato M,Fabbri M,et al. Induction and regulatory function of miR-9 in human monocytes and neutrophils exposed to proinflammatory signals[J]. Proc Natl Acad Sci USA,2009,106(13):5282-5287

[9] Zhang Y,Liao Y,Wang D,et al. Altered expression levels of miRNAs in serum as sensitive biomarkers for early diagnosis of traumatic injury[J]. J Cell Biochem,2011,112(9):2435-2442

[10] Adams JM,Hauser CJ,Livingston DH,et al. Early trauma polymorphonuclear neutrophil responses to chemokines are associated with development of sepsis,pneumonia,and organ failure[J]. J Trauma,2001,51(3):452-457

[11] Hildebrand F,Pape HC,Krettek C. The importance of cytokines in the posttraumatic inflammatory reaction[J]. Unfallchirurg,2005,108(10):793-794

[12] Dupont C,Rodenbach J,Flachaire E. The value of C-reactive protein for postoperative monitoring of lower limb arthroplasty[J]. Ann Readapt Med Phys,2008,51(5):348-357

[13] Krutzfeldt J,Rajewsky N,Braich R,et al. Silencing of microRNAs in vivo with ‘a(chǎn)ntagomirs’[J]. Nature,2005,438(7068):685-689

[14] Weiler J,Hunziker J,Hall J. Anti-miRNA oligonucleotides (AMOs):ammunition to target miRNAs implicated in human disease?[J]. Gene Ther,2006,13(6):496-502

Detection of miR-9 in serum of septic rats and its significance

YANG Jiong1, LI Xinyu2

(1. The 302nd Hospital of PLA, Shule 844200, Xinjiang, China; 2. Urumqi General Hospital of Lanzhou Military Region, Urumqi 830000, Xinjiang, China)

Objective It is to investigates the expression of miR-9 in serum of septic rats, as well as its significance. Methods 54 rats were divided into sham group (n=24), sepsis group (n=24) and normal control group (n=6). Animal models of sepsis were established by cecal ligation and puncture. The serum levels of IL-6, TNF-α and CRP were measured in every group to evaluate the severity of sepsis. The expression level of serum miR-9 was determined by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). Pearson’s correlation analysis was used to evaluate if the expression of serum miR-9 had correlation with IL-6、TNF-α and CRP. Results Expression level of miR-9 in rats’ serum in sepsis group was significantly higher than that in normal control group and sham group (P<0.01), which was very low under normal condition, was significantly increased at 2 h after CLP. Pearson’s correlation analysis also showed that the level of serum miR-9 had positive correlation with IL-6、TNF-α and CRP(P<0.01). Conclusion The significantly up-regulated expression levels of serum miR-9 in septic rats reflected the situation of inflammatory response, and may be used as a diagnostic and prognostic marker in sepsis.

sepsis; serum miR-9; IL-6; TNF-α; CRP

楊炯，男，副主任醫(yī)師，研究方向?yàn)橹匕Y醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)及臨床。

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.04.007

R-332

A

1008-8849(2015)04-0364-04

2014-08-15