楊燕楠，朱海杭

揚(yáng)州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院 蘇北人民醫(yī)院消化內(nèi)科，江蘇 揚(yáng)州225001

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是全球范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤。2014 年，美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)發(fā)布的統(tǒng)計(jì)報(bào)告指出，在美國(guó)男性和女性腫瘤患者中，CRC 的發(fā)病率和病死率呈上升趨勢(shì)，均已位列第3［1］。在我國(guó)，CRC 已成為僅次于肺癌和胃癌的第3 大惡性腫瘤，是消化道常見的惡性腫瘤之一，手術(shù)治療是CRC 的根治方法，而中晚期CRC 患者則依賴于化療、放療以提高5 年內(nèi)生存率［2］。及時(shí)、準(zhǔn)確的診斷對(duì)CRC 患者有著極其重要的臨床意義。近年來，研究［3］顯示CRC 組織中不同微小RNA(microRNA)的表達(dá)水平不同，現(xiàn)對(duì)microRNA 在CRC 早期診斷、治療及預(yù)后中的作用作一概述。

1 microRNA 的生物學(xué)特征

1.1 microRNA microRNA 是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類具有調(diào)控功能的內(nèi)源性的非編碼RNA，其大小約21 ～25 個(gè)核苷酸［4］，具有高度保守性、時(shí)序性和組織特異性［5］。Lee 等［6］在1993 年研究線蟲發(fā)育過程中，首次在秀麗隱桿線蟲發(fā)現(xiàn)microRNA-let4。通過近年來的microRNA 基因譜分析顯示:存在于哺乳動(dòng)物中的microRNA 有1 000 種［7］。多數(shù)哺乳動(dòng)物的microRNA 基因位于內(nèi)含子和外顯子［8-9］，此外，還有基因與內(nèi)含子或外顯子重疊，少數(shù)microRNA 聚集成為一個(gè)microRNA 基因簇。microRNA 的成熟分為3 個(gè)過程:轉(zhuǎn)錄pri-miRNA、pre-miRNA 在細(xì)胞核中生成、成熟microRNA 在細(xì)胞質(zhì)中生成［10-11］。microRNA 與沉默復(fù)合體(RISC)相結(jié)合，通過互補(bǔ)或不完全互補(bǔ)的方式識(shí)別并結(jié)合靶基因，使靶基因的mRNA 裂解或抑制其蛋白翻譯，在轉(zhuǎn)錄后水平影響基因和/或蛋白的表達(dá)。microRNA 作為一類高度保守性的基因，參與了細(xì)胞分化、細(xì)胞周期調(diào)控、應(yīng)激及凋亡等諸多重要程序過程中的基因表達(dá)調(diào)控［12］，多達(dá)30%的人類基因受到microRNA 的調(diào)控。近年來，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)(RT-PCR)已成為分析microRNA 的首選方法，其具有快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)［13］。

1.2 microRNA-499 microRNA-499(miR-499)是一種近年來新發(fā)現(xiàn)的microRNA 家族成員。2005 年，Bentwich 等［14］成功地利用計(jì)算機(jī)模擬分析和microRNA 芯片技術(shù)對(duì)89 種新的microRNA 進(jìn)行克隆和測(cè)序。同時(shí)，Bentwich 等［14］也對(duì)69 種經(jīng)計(jì)算機(jī)模擬得到，但在芯片中沒有發(fā)現(xiàn)的microRNA 成功測(cè)序，其中包括“pred00211”，其后被命名為miR-499。miR-499具有高度保守性，其廣泛存在于人類、大鼠、黑猩猩等十幾種屬的基因組中(http://www.mirase.org)。人類miR-499 由20 號(hào)染色體上肌球蛋白重鏈7b/14 基因(Myh7b/14)的內(nèi)含子20 所編碼。目前研究發(fā)現(xiàn)Myh7b 和miR-499 主要表達(dá)于心肌［15］，同時(shí)骨骼肌和眼外肌也有所表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)在人和小鼠心肌細(xì)胞分化階段，miR-499 在心肌祖細(xì)胞中開始高水平表達(dá)［16］。另外，在大腦、卵巢、肝癌細(xì)胞系(HepG2)等研究組中檢測(cè)到miR-499 的表達(dá)。

2 miR-499 與相關(guān)疾病

2.1 miR-499 與心血管疾病 目前對(duì)于miR-499 的研究主要集中在心血管循環(huán)系統(tǒng)，miR-499 在心肌祖細(xì)胞階段抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞分化。miR-499 可能通過抑制一系列對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育有促進(jìn)作用的基因，抑制蛋白合成，從而促進(jìn)心肌細(xì)胞分化。Wang等［15］發(fā)現(xiàn)miR-499 在正常人血漿中濃度極低，我們用RT-PCR 方法才能檢測(cè)到其水平，但在急性心肌梗死后1 ～3 h 內(nèi)，便可在患者血漿中檢測(cè)到顯著升高的miR-499，并在3 ～12 h 達(dá)到峰值。Adachi 等［17］也證實(shí)血漿中miR-499 濃度可以作為急性心肌梗死的生物學(xué)標(biāo)志，但在充血性心力衰竭患者的血漿中miR-499濃度則沒有明顯變化。Olivieri 等［18］發(fā)現(xiàn)miR-499-5p在非ST 段抬高型的心肌梗塞早期評(píng)估中發(fā)揮著重要的作用。

2.2 miR-499 與肺癌、乳腺癌等 microRNA 與腫瘤相關(guān)研究最早源于Calin 等［19］發(fā)現(xiàn)慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)中染色體13q14 的缺失，此研究表明microRNA-15a 和microRNA-16-1 是這個(gè)缺失區(qū)域內(nèi)僅有的兩個(gè)基因，在接近68% CLL 患者中這兩種基因均有缺失或下調(diào)。其后隨著研究進(jìn)展，相繼在乳腺癌［20］、肺癌［21］、甲狀腺癌等［22］發(fā)現(xiàn)microRNA 的差異性表達(dá)。隨著研究的深入，Li 等［23］研究分析顯示，miR-499 在非小細(xì)胞肺癌組織中表達(dá)上調(diào)，可作為其早期診斷與評(píng)估患者預(yù)后的生物標(biāo)志物。Hu 等［24］對(duì)243 例非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)患者的研究發(fā)現(xiàn)，血清miR-499 的含量與患者的存活率有密切關(guān)系，存活期長(zhǎng)的患者比存活期短的患者血清miR-499 含量高出5 倍以上，使得血清miR-499 含量有望成為NSCLC 患者存活期的評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)，便于指導(dǎo)臨床治療。miR-499 的單核苷酸多態(tài)性影響已在乳腺癌等［25］多種癌癥中得到證實(shí)。通過對(duì)1 009 例乳腺癌患者和1 093 例正常對(duì)照人群的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)與hasmiR-499rs374644 位 點(diǎn) AA 基 因 型 相 比，has-miR-499rs374644:A ＞G 和has-miR-196a2rs11614913:T ＞C與乳腺癌的發(fā)生密切相關(guān)，具有這些基因型的人可能更具有易感性，而且這些單核苷酸多態(tài)性均表達(dá)在成熟microRNA 的3p 端，可能影響microRNA 的加工與表達(dá)。

2.3 microRNA 與CRC Michael 等［26］2003 年首次在結(jié)腸癌組織中發(fā)現(xiàn)異常下降的microRNA-143 和microRNA-145。Kamatani 等［27］采用RT-PCR 技術(shù)檢測(cè)家族性腺瘤息肉病、結(jié)直腸腺瘤和CRC 及配對(duì)的非腫瘤組織中microRNA-143 和microRNA-145 的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)microRNA-143 和microRNA-145 表達(dá)下調(diào)與APC 基因突變有關(guān)，是結(jié)直腸腫瘤發(fā)病的起始步驟。CRC 組織中存在多種microRNA 的異常表達(dá)［28］，這些microRNA 可能為CRC 的早期診斷提供新的分子標(biāo)志物。研究顯示［29］microRNA 不僅在CRC 組織中表達(dá)有顯著差異，同樣也在血液中穩(wěn)定存在，而外周血中的microRNA 足以成為臨床檢測(cè)有效的生物標(biāo)識(shí)。源于腫瘤的microRNA 在血液中避開了內(nèi)源性核糖核酸酶的活性，具有相當(dāng)穩(wěn)定的存在形式。Wang 等［30］發(fā)現(xiàn)血清miR-29a 表達(dá)升高與較晚的CRC 的TNM 分期相關(guān)，鑒別轉(zhuǎn)移與非轉(zhuǎn)移CRC 的敏感度和特異度均達(dá)到75%，較血清癌胚抗原更為敏感(敏感度和特異度分別為60%和34%)。糞便隱血試驗(yàn)簡(jiǎn)單易行，在臨床上作為腸癌普查篩檢和早期診斷的線索，已經(jīng)在microRNA 水平對(duì)糞便標(biāo)本進(jìn)行了相應(yīng)的檢測(cè)。糞便微環(huán)境中microRNA-144 穩(wěn)定存在于糞便中，其在CRC患者的糞便中呈現(xiàn)高表達(dá)，其敏感度為74%，特異度為87%［31］。

2.4 miR-499 與CRC 李新華等［32］采用miRCUR基因芯片(v.14.0)分析直腸癌組織和鄰近非腫瘤組織之間差異表達(dá)的microRNA，設(shè)定平均上升或下降倍數(shù)＞2 倍和P ＜0.05 為差異標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)現(xiàn)在直腸癌組織標(biāo)本中miR-499-5p 異常升高表達(dá)，可能其通過負(fù)性抑制腫瘤抑癌基因和/或控制細(xì)胞的分化或凋亡途徑來促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。Liu 等［33］2011 年運(yùn)用來自大腸癌患者原發(fā)病灶的低轉(zhuǎn)移潛能細(xì)胞系SW480 和來自同一患者一年后轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織的高轉(zhuǎn)移潛能細(xì)胞系SW620 鑒定出參與腫瘤轉(zhuǎn)移的microRNA 分子，miR-499-5p 通過靶向FOX04 和PDCD4 促進(jìn)大腸癌細(xì)胞侵襲和腫瘤轉(zhuǎn)移，由此可見miR-499-5p 在結(jié)腸癌的侵襲和演進(jìn)中起著重要的調(diào)節(jié)作用，miR-499-5p 有望成為CRC 臨床治療的潛在靶點(diǎn)。然而，目前階段對(duì)于miR-499-5p 的研究甚少，其表達(dá)情況和靶向作用機(jī)制有待深入探討。

3 展望

miR-499 的研究主要著重于心血管循環(huán)系統(tǒng)，血清中miR-499 可以作為急性心肌梗塞的早期診斷標(biāo)志物［34］。對(duì)于miR-499 在腫瘤生物學(xué)中的研究只是處于初級(jí)階段，尤其在CRC 的演進(jìn)、侵襲中的作用中有待進(jìn)一步研究。血清/血漿或組織中的miR-499 的水平是否能成為CRC 的早期診斷血清的指標(biāo)?對(duì)于miR-499 在CRC 中作用機(jī)制，判斷其分期、預(yù)后有待進(jìn)一步研究。對(duì)于CRC 患者的血清/血漿中miR-499水平變化情況，在結(jié)腸息肉、炎癥性腸病等變化也需進(jìn)一步探究。microRNA 作為腫瘤研究的熱點(diǎn)已越來越受到關(guān)注，有望作為新的臨床標(biāo)志物，對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸、治療等研究具有重要的臨床意義。

［1］ Siegel R，Ma J，Zou Z，et al. Cancer statistics，2014［J］. CA Cancer J Clin，2014，64(1):9-29.

［2］ Walker AS，Zwintscher NP，Johnson EK，et al. Future directions for monitoring treatment response in colorectal cancer ［J］. J Cancer，2014，5(1):44-57.

［3］ Hong L，Han Y，Zhang H，et al. miR-210:a therapeutic target in cancer［J］. Expert Opin Ther Targets，2013，17(1):21-28.

［4］ Iorio MV，Croce CM. MicroRNA dysregulation in cancer:diagnostics，monitoring and therapeutics. A comprehensive review［J］. EMBO Mol Med，2012，4(3):143-159.

［5］ Wu J，Ji X，Zhu L，et al. Up-regulation of microRNA-1290 impairs cytokinesis and affects the reprogramming of colon cancer cells［J］.Cancer Lett，2013，329(2):155-163.

［6］ Lee RC，F(xiàn)einbaum RL，Ambros V. The C.elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14［J］.Cell，1993，75(5):843-854.

［7］ Garzon R，Calin GA，Croce CM. MicroRNAs in cancer［J］. Annu Rev Med，2009，60:167-179.

［8］ Takahashi RU，Miyazaki H，Ochiya T. The role of microRNAs in the regulation of cancer stem cells［J］. Front Genet，2014，4:295.

［9］ Rossi S，Di Narzo AF，Mestdagh P，et al. microRNAs in colon cancer:a roadmap for discovery［J］. FEBS Lett，2012，586(19):3000-3007.

［10］ Bandiera S，Barrey E，Ernoult-Lange M，et al. Mitochondria microRNA and RNA interference［J］. Med Sci(Paris)，2012，28(1):23-26.

［11］ Ul Hussain M. Micro-RNAs (miRNAs):genomic organisation，biogenesis and mode of action［J］. Cell Tissue Res，2012，349(2):405-413.

［12］ Guo L，Zhao Y，Zhang H，et al. Integrated evolutionary analysis of human miRNA gene clusters and families implicates evolutionary relationships［J］. Gene，2014，534(1):24-32.

［13］ Pfitzner C，Schr?der I，Scheungraber C，et al. Digital-Direct-RTPCR:a sensitive and specific method for quantification of CTC in patients with cervical carcinoma［J］. Sci Rep，2014，4:3970.

［14］ Bentwich I，Avniel A，Karov Y，et al. Identification of hundreds of conserved and nonconserved human microRNAs ［J］. Nat Genet，2005，37(7):766-770.

［15］ Wang GK，Zhu JQ，Zhang JT，et al. Circulating microRNA:a novel potential biomarker for early diagnosis of acute myocardial infarction in humans［J］. Eur Heart J，2010，31(6):659-666.

［16］ Sluijter JP，van Mil A，van Vliet P，et al. MicroRNA-1 and-499 regulate differentiation and proliferation in human-derived cardiomyocyte progenitor cells［J］. Arterioscler Thromb Vasc Biol，2010，30(4):859-868.

［17］ Adachi T，Nakanishi M，Otsuka Y，et al. Plasma microRNA 499 as a biomarker of acute myocardial infarction［J］. Clin Chem，2010，56(7):1183-1185.

［18］ Olivieri F，Antonicelli R，Spazzafumo L，et al. Admission levels of circulating miR-499-5p and risk of death in elderly patients after acute non-ST elevation myocardial infarction［J］. Int J Cardiol，2014，172(2):e276-e278.

［19］ Calin GA，Dumitru CD，Shimizu M，et al. Frequent deletions and down-regulation of micro-RNA genes miR15 and miR16 at 13q14 in chronic lymphocytic leukemia［J］. Proc Natl Acad Sci U S A，2002，99(24):15524-15529.

［20］ Singh R，Mo YY. Role of microRNAs in breast cancer［J］. Cancer Biol Ther，2013，14(3):201-212.

［21］ Wang XC，Du LQ，Tian LL，et al. Expression and function of miRNA in postoperative radiotherapy sensitive and resistant patients of non-small cell lung cancer［J］. Lung Cancer，2011，72(1):92-99.

［22］ Zhang X，Li M，Zuo K，et al. Upregulated miR-155 in papillary thyroid carcinoma promotes tumor growth by targeting APC and activating Wnt/β-catenin signaling［J］. J Clin Endocrinol Metab，2013，98(8):E1305-E1313.

［23］ Li M，Zhang Q，Wu L，et al. Serum miR-499 as a novel diagnostic and prognostic biomarker in non-small cell lung cancer［J］. Oncol Rep，2014，31(4):1961-1967.

［24］ Hu Z，Chen X，Zhao Y，et al. Serum microRNA signatures identified in a genome-wide:serum microRNA expression profiling predict survival of non-small-cell lung cancer ［J］. J Clin Oncol，2010，28(10):1721-1726.

［25］ Omrani M，Hashemi M，Eskandari-Nasab E，et al. hsa-mir-499 rs3746444 gene polymorphism is associated with susceptibility to breast cancer in an Iranian population［J］. Biomark Med，2014，8(2):259-267.

［26］ Michael MZ，O'Connor SM，van Holst Pellekaan NG，et al. Reduced accumulation of specific microRNAs in colorectal neoplasia［J］. Mol Cancer Res，2003，1(12):882-891.

［27］ Kamatani A，Nakagawa Y，Akao Y，et al. Downregulation of anti-oncomirs miR-143/145 cluster occurs before APC gene aberration in the development of colorectal tumors［J］. Med Mol Morphol，2013，46(3):166-171.

［28］ Shivapurkar N，Weiner LM，Marshall JL，et al. Recurrence of early stage colon cancer predicted by expression pattern of circulating microRNAs［J］. PLoS One，2014，9(1):e84686.

［29］ Mitchell PS，Parkin RK，Kroh M，et al. Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection［J］. Proc Natl Acad Sci U S A，2008，105(30):10513-10518.

［30］ Wang LG，GU J. Serum microRNA-29a is a promising novel marker for early detection of colorectal liver metastasis［J］. Cancer Epidemiol，2012，36(1):e61-e67.

［31］ Kalimutho M，Del Vecchio Blanco G，Di Cecilia S，et al. Differential expression of miR-144* as a novel fecal-based diagnostic marker for colorectal cancer［J］. J Gastroenterol，2011，46(12):1391-1402.

［32］ Li XH，Zhang GY，Li Q，et al. Identification of aberrantly expressed miRNAs in rectal cancer［J］. J Cent South Univ (Med Sci)，2012，37(7):662-668.李新華，張桂英，李乾，等. 直腸癌組織異常表達(dá)miRNAs 的鑒定［J］. 中南大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2012，37(7):662-668.

［33］ Liu X，Zhang Z，Sun L，et al. microRNA-499-5p promotes cellular invasion and tumor metastasis in colorectal cancer by targeting FOXO4 and PDCD4［J］. Carcinogenesis，2011，32(12):1798-1805.

［34］ Xiao J，Shen B，Li J，et al. Serum microRNA-499 and microRNA-208a as biomarkers of acute myocardial infarction［J］. Int J Clin Exp Med，2014，7(1):136-141.