鄧洪鈞，白曉磊，方 昕，余森泉，鄭 宇，王 敏*

(1．工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457;

2．天津科技大學(xué)信息化辦公室，天津300222)

醋酸菌(Acetic acid bacteria)是一類(lèi)能將乙醇氧化成醋酸等產(chǎn)物的細(xì)菌。醋酸菌具有較強(qiáng)的氧化乙醇生成醋酸的能力，且具有較高的醋酸耐受性，被廣泛用于食醋液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)，也是在食醋固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程中的主要產(chǎn)酸菌［1］。醋酸菌通過(guò)定位于細(xì)胞膜上的依賴輔酶PQQ(吡咯喹啉醌)的乙醇脫氫酶和乙醇脫氫酶完成從乙醇到醋酸的生化反應(yīng)［2］。

對(duì)醋酸發(fā)酵來(lái)說(shuō)，菌株的發(fā)酵效率是決定生產(chǎn)效率的主要因素。醋酸菌的醋酸發(fā)酵最適溫度為30～32℃。如果發(fā)酵溫度能夠由30℃提高到37℃，那么發(fā)酵冷卻成本可以降低約50%，因此優(yōu)良醋酸發(fā)酵菌種的選育對(duì)食醋釀造工業(yè)的發(fā)展具有重要的意義［3－4］。孫文瑛等［5］篩選到一株具有耐高溫(36℃)、高乙醇(11%)的醋酸菌，經(jīng)優(yōu)化后其醋酸產(chǎn)量達(dá)到48．6 g/L。邵建寧等［6］通過(guò)紫外線、硫酸二乙酯逐級(jí)誘變選育得到兩株醋酸菌，在培養(yǎng)溫度40℃、培養(yǎng)基乙醇濃度12%(V/V)條件下發(fā)酵，酒精轉(zhuǎn)化率分別達(dá)到70%和75%。

隨著生物技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)已能夠利用基因工程的方法構(gòu)建具有較高醋酸發(fā)酵能力的菌株，但從自然界中篩選和誘變選育仍然是食醋發(fā)酵菌種選育的首選方法［7－9］。武斌等［10］從山西老陳醋醋醅中篩選出一株巴氏醋桿菌S12，利用N+注入誘變的方法提高該菌株的發(fā)酵效率。臧晉等［11］從天然發(fā)酵醋醅中分離出高產(chǎn)醋酸菌株，通過(guò)氯化鋰和紫外線復(fù)合處理誘變獲得優(yōu)良的醋酸發(fā)酵菌株J11－4。采用酸激復(fù)合紫外誘變方法篩選醋酸發(fā)酵菌株，發(fā)酵結(jié)束醋酸濃度達(dá)到(84．64±0．24)g/L，轉(zhuǎn)化率達(dá)到86．36% ±0．38%［12］。其他常用于醋酸發(fā)酵菌株選育的方法還有紫外誘變、微波誘變以及鹽酸羥胺等化學(xué)誘變的方法［13－15］。

常壓室溫等離子體(atmospheric and room temperature plasma，ARTP)誘變是一種新型誘變育種技術(shù)。與其他誘變方法相比，ARTP具有操作簡(jiǎn)單、安全性高、環(huán)境友好、突變速度快、突變率高、突變多樣性大等特點(diǎn)［16］。筆者以從山西老陳醋醋醅中篩選獲得的一株具有較好耐溫特性的巴氏醋桿菌(Acetobacter pasteurianus)WL021為出發(fā)菌株，利用ARTP方法進(jìn)行誘變處理，以提高其發(fā)酵效率，為其進(jìn)一步在醋酸發(fā)酵工業(yè)的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 菌種 巴氏醋桿菌(Acetobacter pasteurianus)WL021和巴氏醋桿菌WL021－1，在天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院微生物制藥研究室保存。

1．2 培養(yǎng)基 平板培養(yǎng)基組成為葡萄糖15 g/L，酵母膏10 g/L，碳酸鈣20 g/L，瓊脂 17 g/L，乙醇 3．5%(V/V);種子培養(yǎng)基組成為葡萄糖 20 g/L，酵母膏15 g/L，乙醇3．5%(V/V);發(fā)酵培養(yǎng)基組成為葡萄糖20 g/L，酵母膏15 g/L，乙醇7．0%(V/V)、乙酸 1．0%(V/V)。

1．3 醋酸發(fā)酵方法

1．3．1 種子液制備。在種子培養(yǎng)基(250 ml搖瓶，40 ml裝液量)中接入醋酸菌，培養(yǎng)溫度為35℃，搖床轉(zhuǎn)速為180 r/min，培養(yǎng)27 h左右。

1．3．2 搖瓶發(fā)酵。在發(fā)酵培養(yǎng)基(500 ml搖瓶，100 ml裝液量)中，按10%的接種量接入醋酸菌種子液，在發(fā)酵溫度35℃、搖床轉(zhuǎn)速180 r/min的條件下進(jìn)行發(fā)酵，待發(fā)酵液中乙醇濃度低于0．5%時(shí)，發(fā)酵結(jié)束。

1．3．3 發(fā)酵罐發(fā)酵。按10%的接種量將二級(jí)種子培養(yǎng)液接入發(fā)酵罐中(15 L發(fā)酵罐，10 L裝液量)，控制發(fā)酵溫度為前期35℃，通風(fēng)量控制為0．15 vvm，連續(xù)2次測(cè)定酸度未上升，發(fā)酵結(jié)束。

1．4 耐溫醋酸菌的篩選 在超凈臺(tái)上，取10 g醋醅樣品，置于含有90 ml發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，在40℃、180 r/min條件下培養(yǎng)3 d。吸取培養(yǎng)液1 ml，利用無(wú)菌生理鹽水適當(dāng)稀釋后涂布于固體平板培養(yǎng)基，挑單菌落劃線于新的平板中，兩次分離、純化后獲得純菌株。

1．5 醋酸菌的鑒定 挑取平板上的醋酸菌于種子培養(yǎng)基中，40℃培養(yǎng)2 d后利用細(xì)菌基因組提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取基因組。以提取出的基因組為模板，選用細(xì)菌通用上下游引物27F(AGAGTTTGATCCTGGCTCA)、1492R(GGTTACCTTGTTACGACTT)，擴(kuò)增 16SrDNA 片段，反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性5 min，然后經(jīng)30個(gè)循環(huán)(95℃30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s)，最后 72 ℃延伸 8 min。濃度1．5%瓊脂糖凝膠電泳切膠純化回收條帶，送華大基因公司測(cè)序，將測(cè)序序列進(jìn)行BLAST比對(duì)。

1．6 醋酸菌WL021最適發(fā)酵溫度優(yōu)化 按10%接種量向發(fā)酵培養(yǎng)基中接入巴氏醋桿菌WL021種子液，培養(yǎng)溫度分別為30、35、40、45 ℃，搖床轉(zhuǎn)速為 180 r/min，當(dāng)酸度不再增加時(shí)發(fā)酵結(jié)束，確定最佳的發(fā)酵溫度。

1．7 ARTP誘變及菌株選育

1．7．1 ARTP誘變時(shí)間的確定。將巴氏醋桿菌WL021接種于種子培養(yǎng)基，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中期，發(fā)酵液4 000 r/min離心10 min，菌體用生理鹽水(0．85%)洗滌2遍后重懸，備用。

使用ARTP等離子體誘變儀，工作氣體為高純氦氣，取7份10μl上述菌懸液于載玻片上進(jìn)行誘變處理。儀器輸出功率120 W，輻照距離2 mm，氣流量10 SLM，處理時(shí)間分別為0、15、20、25、30、35、40、45 s。將處理后的菌液適當(dāng)稀釋后涂布，35℃下培養(yǎng)，計(jì)算致死率。每個(gè)梯度設(shè)3個(gè)平行。

1．7．2 誘變菌株的初篩。將誘變處理后的菌液涂布于平板培養(yǎng)基上，35℃下倒置培養(yǎng)48 h，隨機(jī)挑選單菌落點(diǎn)接到含碳酸鈣的平板培養(yǎng)基上，點(diǎn)接原始菌為對(duì)照，35℃下培養(yǎng)48 h，選取相對(duì)原始菌HC(透明圈直徑/菌落直徑)大的菌株為初篩突變株。

1．7．3 誘變菌株搖瓶復(fù)篩。按10%的接種量向發(fā)酵培養(yǎng)基中接入醋酸菌(500 ml搖瓶，100 ml裝液量)，在35℃、搖床轉(zhuǎn)速180 r/min的條件下發(fā)酵48 h，選取具有較高發(fā)酵效率的菌株進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1．8 分析方法 采用滴定法測(cè)定總酸濃度，以酚酞為指示劑，用0．1 mol/L氫氧化鈉溶液將發(fā)酵液滴定至粉紅色，計(jì)算總酸濃度。

2 結(jié)果與分析

2．1 醋酸菌WL021的分離、純化與鑒定 從山西老陳醋醋醅中分離、純化獲得一株能夠在40℃條件下生長(zhǎng)且能夠利用乙醇產(chǎn)生透明圈的的醋酸菌，命名為WL021。其菌落菌體形態(tài)如圖1所示。菌落形態(tài)為圓形，白色，凸起;顯微鏡觀察菌體形態(tài)為短桿狀，成串或單個(gè)存在，革蘭氏染色呈陰性。利用PCR方法擴(kuò)增菌株WL021的16SrDNA送華大基因公司測(cè)序，將該菌株序列16SrDNA輸入Genbank進(jìn)行Blast序列比對(duì)，結(jié)果表明它與Acetobacter pasteurianus(GenBamk ID:AB680032．1)的同源性為99%。

2．2 巴氏醋桿菌WL021最適發(fā)酵溫度 溫度對(duì)醋酸菌生長(zhǎng)和醋酸發(fā)酵有很大的影響。雖然巴氏醋桿菌WL021是在40℃條件下篩選出來(lái)的，但仍需要對(duì)其最適生長(zhǎng)和醋酸發(fā)酵溫度進(jìn)行研究。由圖2可知，發(fā)酵24 h后巴氏醋桿菌WL021進(jìn)入快速產(chǎn)酸階段，35℃下菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酸速率最快。目前生產(chǎn)上常用的醋酸菌(如AS1．41、滬釀1．01)發(fā)酵溫度一般均為30℃。巴氏醋桿菌WL021具有較好的耐熱性，可耐受40℃溫度，但其最適的醋酸發(fā)酵溫度為35℃。在此溫度下醋酸發(fā)酵不僅具有較高的發(fā)酵效率，并且有利于減少發(fā)酵罐冷卻成本。為了提高該菌株的發(fā)酵效率，采用ARTP的方法對(duì)其進(jìn)行誘變選育。

2．3 ARTP誘變選育醋酸菌

2．3．1 ARTP誘變時(shí)間的確定。選擇對(duì)數(shù)中期作為菌種的較適誘變時(shí)期，將活化的巴氏醋桿菌WL021在種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)約20 h時(shí)進(jìn)行誘變處理。誘變時(shí)間對(duì)致死率的影響如圖3所示。進(jìn)一步試驗(yàn)選取的誘變處理時(shí)間為25 s。

2．3．2 誘變菌株的篩選。利用ARTP誘變儀對(duì)巴氏醋桿菌WL021進(jìn)行誘變處理，誘變時(shí)間為25 s。隨機(jī)挑選誘變后的菌落100個(gè)。根據(jù)透明圈出現(xiàn)的時(shí)間和HC大小(表1)，初步選擇7株突變菌進(jìn)行進(jìn)一步試驗(yàn)。

在搖瓶中利用發(fā)酵培養(yǎng)基對(duì)篩選出的7株誘變菌株和出發(fā)菌株進(jìn)行醋酸發(fā)酵。由表1可知，搖瓶發(fā)酵48 h后，7株誘變株產(chǎn)酸量均高于出發(fā)菌株，其中誘變株WL021-1產(chǎn)酸量達(dá)54．29±3．40 g/L，與出發(fā)菌株相比提高約50%。將巴氏醋桿菌WL021-1在斜面培養(yǎng)基上連續(xù)傳代10次后其醋酸

表1 菌株HC值和發(fā)酵產(chǎn)酸比較

2．4 發(fā)酵罐醋酸發(fā)酵穩(wěn)定性試驗(yàn) 利用巴氏醋桿菌WL021-1在15 L發(fā)酵罐中分別進(jìn)行3批醋酸發(fā)酵。發(fā)酵溫度為35℃，發(fā)酵初始乙醇濃度為7%，初始醋酸濃度為10g/ml，每分鐘通氣量為0．15 vvm，連續(xù)2次測(cè)定，發(fā)現(xiàn)酸度未上升，結(jié)束發(fā)酵。由表2可知，與出發(fā)菌株相比，巴氏醋桿菌WL021-1醋酸發(fā)酵的產(chǎn)酸量和酒精轉(zhuǎn)化率沒(méi)有明顯差異，但發(fā)酵周期縮短，發(fā)酵效率提高約10%。該菌株三批次醋酸發(fā)酵過(guò)程中發(fā)酵周期和產(chǎn)酸基本穩(wěn)定，酒精轉(zhuǎn)化率大于90%，說(shuō)明該菌株具有潛在的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。

表2 巴氏醋桿菌WL021-1醋酸發(fā)酵穩(wěn)定性試驗(yàn)

3 結(jié)論

從山西老陳醋醋醅中篩選獲得能夠在40℃條件下生長(zhǎng)的醋酸菌WL021。16SrDNA序列分析結(jié)果表明，該菌株屬于巴氏醋桿菌。該菌株最適的生長(zhǎng)和醋酸發(fā)酵溫度為35℃。利用常溫等離子誘變的方法對(duì)菌株WL021進(jìn)行誘變處理，選育獲得35℃條件下具有較高醋酸發(fā)酵效率的菌株WL021-1。利用15 L自吸式發(fā)酵罐，進(jìn)行巴氏醋桿菌WL021-1醋酸發(fā)酵試驗(yàn)。在發(fā)酵初始乙醇濃度7%，初始醋酸濃度10 g/ml，35℃，通氣量0．15 vvm條件下，巴氏醋桿菌WL021-1平均發(fā)酵周期為59 h，終酸濃度為74．9 g/ml，乙醇轉(zhuǎn)化率約為93%，平均發(fā)酵效率為1．10 g/(ml·h)，與出發(fā)菌株相比發(fā)酵效率提高約10%。

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