韓秀麗，趙浩浩，魯 峰，常 春，何玉遠(yuǎn)

(1．鄭州大學(xué) 化工與能源學(xué)院，河南 鄭州450001;2．河南省周口市環(huán)境監(jiān)測站，河南 周口466002)

0 引言

隨著各國對能源需求的增加，利用纖維原料生產(chǎn)纖維乙醇成為國內(nèi)外學(xué)者的研究熱點［1］． 目前，纖維乙醇項目存在的技術(shù)瓶頸主要有:廢水處理問題;纖維原料的預(yù)處理能耗較大［2-3］;秸稈運輸儲存困難;生產(chǎn)所需纖維素酶的成本高［4-5］，這些因素導(dǎo)致纖維乙醇生產(chǎn)成本居高難下，每生產(chǎn)1 t 纖維乙醇約產(chǎn)生20 t 廢水．而隨著纖維乙醇生產(chǎn)規(guī)模的擴大，需要處理的廢水量巨大［6］;同時，纖維乙醇廢水污染負(fù)荷高、組分復(fù)雜，具有色度高和COD(化學(xué)需氧量，Chemical Oxyen Demand)高的特點，是一種難處理的工業(yè)廢水．目前，蒸餾廢液以采用“厭氧-好氧法”生物處理工藝為主，最終的廢水(COD 約300 ～400 mg/L)還需排放進入城市污水處理系統(tǒng)，加大了城市污水處理負(fù)荷．廢水好氧處理法投入大、難達(dá)標(biāo)［7］，好氧處理成本達(dá)10 元/t，并且好氧污泥造成的污染隱患也依然存在．因此，要發(fā)展纖維乙醇工業(yè)，必須解決其高濃度廢水污染問題．

纖維乙醇廢水首先經(jīng)厭氧發(fā)酵生產(chǎn)沼氣處理，然后將沼液作為工藝配料用水回用于纖維乙醇生產(chǎn)過程，這是解決纖維乙醇廢水污染最有效的途徑［8］．廢水的回用［9］不僅可以節(jié)約水資源，而且可減少廢水排放對環(huán)境的污染［10］，從而降低纖維乙醇生產(chǎn)成本．

厭氧發(fā)酵生產(chǎn)沼氣過程主要包括3 個階段:①水解液化階段，發(fā)酵性細(xì)菌所分泌的胞外酶將沼氣原料中的非水溶性有機物轉(zhuǎn)化為可溶性的有機酸和醇類等;②產(chǎn)酸階段，主要是把第一階段的產(chǎn)物丙酸、丁酸、乳酸和醇類等在產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌的作用下轉(zhuǎn)化為乙酸，同時產(chǎn)生H2和CO2;③產(chǎn)甲烷階段，是利用產(chǎn)甲烷菌將乙酸和H2、CO2等轉(zhuǎn)化為沼氣．厭氧產(chǎn)沼氣后的沼液中含有少量甲酸、乙酸和丙酸等小分子有機酸，這些物質(zhì)累積到一定程度就會對酵母生長和乙醇發(fā)酵產(chǎn)生抑制． 筆者主要研究了甲酸、乙酸和丙酸等小分子有機酸對纖維素酶解和乙醇發(fā)酵的影響，旨在為纖維乙醇廢水回用提供理論支撐．

1 實驗部分

1．1 實驗材料和儀器

材料:汽爆玉米秸稈，河南天冠企業(yè)集團有限公司;纖維素酶，諾維信(中國)生物技術(shù)有限公司，酶活為1 381 U/mL(濾紙酶活法);安琪耐高溫型釀酒高活性干酵母，湖北安琪酵母股份有限公司;所用試劑均為分析純．

儀器:UV-2102 PC 型紫外可見分光光度計，尤尼柯上海儀器有限公司;FIWE3/6 纖維素測定儀，北京盈盛恒泰科技有限責(zé)任公司;PHS -3S型精密酸度計，上海大普儀器有限公司;HZ -9311K 恒溫振蕩器，太倉市科教器材廠;數(shù)顯恒溫水浴鍋，鄭州長城科工貿(mào)有限公司;電熱手提壓力蒸汽消毒器，上海醫(yī)用核子儀器廠．

1．2 酵母的活化

用5 mol/L 的H2SO4將2%葡萄糖水溶液的pH 值調(diào)到4．5 ～5．0，于121 ℃的滅菌鍋中滅菌20 min，冷卻至40 ℃，向50 mL 的上述滅菌后的葡萄糖水溶液中加入3 g 干酵母，在38 ℃的恒溫水浴中保溫30 min，即可做酒母使用．

1．3 實驗方法

酶解:按照底物濃度15%的比例，稱取一定量的汽爆玉米秸稈置于三口燒瓶中，然后分別加入一定量pH 4．8 的檸檬酸緩沖溶液、纖維素酶和聚乙二醇，搖勻，將三口燒瓶放入到50 ℃恒溫水浴，以200 r/min 攪拌速度酶解48 h，酶解液經(jīng)離心機離心后，取上清液，適當(dāng)稀釋后測其還原糖濃度．

發(fā)酵:取150 mL 酶解液，酵母接種量1%(體積分?jǐn)?shù))，搖勻后封口，放入34 ℃恒溫?fù)u床中震蕩，搖床轉(zhuǎn)速為160 r/min，發(fā)酵一定時間后，取樣測定其乙醇含量和殘余還原糖濃度．

1．4 分析方法

1．4．1 玉米秸稈成分分析

蒸汽爆破后的玉米秸稈成分采用纖維素測定儀測定． 其主要成分為:纖維素31．68%;半纖維素17．62%;木質(zhì)素22．11%;灰分10．64%;其他17．95%(均為質(zhì)量分?jǐn)?shù))．

1．4．2 還原糖濃度的測定

采用3，5-二硝基水楊酸(DNS 試劑)法測定［11］．取0．5 mL 稀釋至一定倍數(shù)的酶解液于25 mL 比色管中，加入pH 4．8 的檸檬酸緩沖液1．5 mL 和DNS 3 mL，混勻，將比色管置于沸水浴中反應(yīng)10 min，取出迅速冷卻至室溫，用蒸餾水定容至25 mL，混勻，用1 cm 比色皿在波長540 nm 處測量吸光度，用標(biāo)準(zhǔn)曲線法求出還原糖葡萄糖的含量．

1．4．3 乙醇含量(體積分?jǐn)?shù))的測定

取100 mL 發(fā)酵液和等體積的蒸餾水于三口燒瓶中進行蒸餾，用容量瓶收集100 mL 餾出液，然后用重鉻酸鉀比色法［11］，在波長610 nm 處測定吸光度，求出乙醇含量．

2 結(jié)果與討論

2．1 甲酸、乙酸和丙酸對酶解的影響

纖維乙醇廢水經(jīng)厭氧發(fā)酵生產(chǎn)沼氣處理后的沼液廢水中含有甲酸、乙酸和丙酸等小分子有機酸，這些有機酸影響纖維素酶的糖化效率．酶解試驗的條件為:pH 4．8;底物濃度15%(質(zhì)量分?jǐn)?shù));聚乙二醇0．15%(質(zhì)量分?jǐn)?shù));纖維素酶用量50 U/g(纖維素量);酶解時間48 h．為考察小分子有機酸對酶解的影響，向酶解液中加入不同濃度的甲酸、乙酸和丙酸，按照1．3 中的實驗方法進行酶解，酶解48 h 后，測定酶解液的還原糖濃度和pH值，結(jié)果見圖1．

圖1 不同濃度的有機酸對還原糖濃度和酶解液最終pH 的影響Fig．1 Effect of organic acid on reducing sugar concentrations and final pH values of enzymatic solution

按照上述方法加入有機酸后，再用5 mol/L氫氧化鈉溶液分別調(diào)節(jié)酶解液的初始pH 值為4．8，然后進行酶解48 h，考察調(diào)節(jié)酶解液的pH 值后3種酸對酶解糖化效率的影響，結(jié)果如圖1 所示．

由圖1 可以看出，甲酸、乙酸和丙酸對酶解的影響表現(xiàn)出相似的規(guī)律．隨著酸濃度的增加，酶解液的pH 值逐漸降低，酶解48 h 后所得的還原糖濃度也呈下降趨勢．當(dāng)加入甲酸、乙酸，丙酸的濃度均為2 g/L 時，酶解液的pH 值分別為4． 01，4．47和4．55，所對應(yīng)的還原糖濃度分別為51．7，54．6，54．6 g/L．可以看出，添加甲酸的酶解液pH值降低較明顯，強于乙酸和丙酸，而且所對應(yīng)的還原糖濃度降低也比較顯著，這主要是由于甲酸的酸性強于乙酸和丙酸，pH 值的改變影響了纖維素酶的活性，降低了纖維素酶的反應(yīng)速率，從而使最終的還原糖濃度降低．

從圖1 還可以看出，加不同量的有機酸，再將酶解液的pH 值調(diào)節(jié)為4．8 后進行酶解，得到的最終還原糖濃度與不加有機酸相比沒有明顯差別．因此，一定濃度的甲酸、乙酸和丙酸對酶解的影響主要是由酸度引起的，可通過調(diào)節(jié)酶解液的pH值來消除小分子有機酸對酶解糖化效率的影響．

2．2 甲酸、乙酸和丙酸對乙醇發(fā)酵的影響

經(jīng)厭氧沼氣發(fā)酵可去除纖維乙醇廢水中80%以上的COD，但出水的COD 仍然可達(dá)3 000 mg/L 以上，其中含有未轉(zhuǎn)化成沼氣的甲酸、乙酸、丙酸等小分子有機酸． 廢水回用過程中含有的這些有機酸會對乙醇發(fā)酵造成影響． 不同的有機酸對乙醇發(fā)酵和耗糖率的抑制作用差別很大，這是由于細(xì)胞膜具有選擇性，對于不同的有機酸，其通透性是不同的．不同的酸根離子在細(xì)胞內(nèi)的存在形式也有差異，對細(xì)胞內(nèi)外的濃度影響也不相同．

2．2．1 甲酸對乙醇發(fā)酵的影響

按照試驗方法進行發(fā)酵，發(fā)酵前向醪液中添加不同量的甲酸，使?jié)舛确謩e為0，0．6，1．2，1．6，2．0，2．5，3．0 g/L，酵母接種量1%(體積分?jǐn)?shù))，發(fā)酵12，24，36，48，60 h 后取樣，分別測其乙醇含量和還原糖濃度，結(jié)果見圖2 和圖3．

甲酸是沼氣發(fā)酵的一種前驅(qū)體物質(zhì)，在厭氧過程中，甲酸可直接被甲烷菌利用轉(zhuǎn)化成沼氣．當(dāng)發(fā)酵醪液中的甲酸達(dá)到一定濃度時，會對乙醇發(fā)酵產(chǎn)生抑制作用．從圖2 和圖3 可看出，隨著甲酸濃度的增加，乙醇發(fā)酵受到抑制，酵母開始發(fā)酵的時間延長，與此同時耗糖速率也開始減慢．當(dāng)甲酸濃度較低時，甲酸并未對乙醇發(fā)酵產(chǎn)生明顯影響．當(dāng)甲酸濃度達(dá)到1．6 g/L 時，乙醇發(fā)酵開始表現(xiàn)出明顯的抑制現(xiàn)象，最終發(fā)酵液中乙醇含量與對照組相比也明顯減少，與之對應(yīng)的殘還原糖量也在增加．當(dāng)甲酸濃度達(dá)到3 g/L 時，乙醇發(fā)酵幾乎被完全抑制．乙醇發(fā)酵的抑制作用主要表現(xiàn)在前期，酵母的數(shù)量增加慢，從而使乙醇含量低，耗糖速率慢．由此可知，甲酸對乙醇發(fā)酵的抑制濃度為1．6 g/L．

圖2 不同濃度的甲酸對發(fā)酵液乙醇含量的影響Fig．2 Effect of formic acid on ethanol production at different fermentation times

圖3 不同濃度的甲酸對耗糖速率的影響Fig．3 Effect of formic acid on reducing sugar consumption

2．2．2 乙酸對乙醇發(fā)酵的影響

在發(fā)酵液中加不同量的乙酸，使其濃度分別為0，1，2，3，3．5，4，6 g/L，酵母接種量1%(體積分?jǐn)?shù))，按照試驗方法進行發(fā)酵，發(fā)酵12，24，36，48，60 h 后，分別測定發(fā)酵液中乙醇含量和還原糖濃度，結(jié)果見圖4 和圖5．

乙酸是沼氣發(fā)酵中產(chǎn)生甲烷的主要前驅(qū)體物質(zhì)，因此在厭氧發(fā)酵沼液中有少量存在．若在發(fā)酵過程中污染了乙酸菌，也會產(chǎn)生乙酸．從圖4 和圖5 可以看出，當(dāng)乙酸濃度較低時，乙酸不僅不會對酵母發(fā)酵產(chǎn)生抑制作用，相反還會促進發(fā)酵．在乙酸濃度為1 g/L 時，發(fā)酵60 h 后乙醇含量與對照組相比略有提高，這可能是由于乙酸濃度較低時，酵母可以利用低濃度的乙酸作為碳源進行發(fā)酵產(chǎn)乙醇． 當(dāng)乙酸達(dá)到3 g/L 時，將會抑制酵母的生長，主要表現(xiàn)在發(fā)酵的前期，酵母的數(shù)量與對照組相比增加較慢，但酵母仍保持自身的活性，與此同時發(fā)酵液中的耗糖速率也較慢，發(fā)酵結(jié)束后，添加組與對照組相比乙醇含量略有降低． 隨著乙酸濃度繼續(xù)增加，當(dāng)乙酸濃度達(dá)到6 g/L 時，乙醇發(fā)酵幾乎被完全抑制，糖幾乎不被消耗．由此可知，乙酸對乙醇發(fā)酵的抑制濃度為3 g/L．

圖4 不同濃度的乙酸對發(fā)酵液乙醇含量的影響Fig．4 Effect of acetic acid on ethanol production at different fermentation time

圖5 不同濃度的乙酸對耗糖速率的影響Fig．5 Effect of acetic acid on reducing sugar consumption

2．2．3 丙酸對乙醇發(fā)酵的影響

在發(fā)酵液中加入同量的丙酸，使其濃度分別為0，1，2，3，3．5，4，5 g/L，酵母接種量1%(體積分?jǐn)?shù))，按照試驗方法進行發(fā)酵，發(fā)酵12，24，36，48，60 h 后取樣，分別測定其乙醇含量和還原糖濃度，結(jié)果見圖6 和圖7．

丙酸是沼氣發(fā)酵中一個重要的中間產(chǎn)物，與其他中間產(chǎn)物相比，丙酸轉(zhuǎn)化甲烷的速率是最慢的，而且它也是沼氣發(fā)酵的限制性物質(zhì)，若發(fā)酵條件的控制不當(dāng)，易造成丙酸型發(fā)酵．從圖6 和圖7 可以看出，當(dāng)丙酸濃度低于2 g/L 時，與對照組相比，丙酸對乙醇發(fā)酵和耗糖速率沒有明顯的差別．丙酸濃度高于3 g/L 時，乙醇的發(fā)酵開始表現(xiàn)出明顯的抑制現(xiàn)象，酵母的生長也受到了抑制，耗糖速率也開始減慢．隨著丙酸濃度的增加，丙酸對乙醇發(fā)酵的抑制作用越來越強烈，當(dāng)丙酸濃度為5 g/L 時，乙醇發(fā)酵抑制率可達(dá)80%． 由此可知，丙酸對乙醇發(fā)酵和耗糖的抑制濃度為3 g/L．

圖6 不同濃度的丙酸對乙醇含量的影響Fig．6 Effect of propanoic acid on ethanol production at different fermentation time

圖7 不同濃度的丙酸對耗糖速率的影響Fig．7 Effect of propanoic acid on reducing sugar consumption

2．2．4 有機酸對乙醇發(fā)酵的抑制機理［12］

由于酵母細(xì)胞內(nèi)的pH 值接近中性，未解離的有機弱酸通過擴散的方式穿過細(xì)胞膜進入細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，在胞內(nèi)不斷地發(fā)生解離，造成了胞內(nèi)質(zhì)子濃度的不斷增加，破壞了胞內(nèi)質(zhì)子梯度，使得膜電位降低．為了維持胞內(nèi)pH 值在最佳的代謝范圍，細(xì)胞必需依靠ATP 產(chǎn)生能量將質(zhì)子運出胞外以維持細(xì)胞內(nèi)中性環(huán)境．由于細(xì)胞內(nèi)能量的大量消耗，又不能及時得到補充，使得必需的酶、輔酶和營養(yǎng)物質(zhì)缺乏，就會對細(xì)胞代謝速率和原料利用速率產(chǎn)生抑制作用，從而影響了酵母發(fā)酵過程．

3 結(jié)論

構(gòu)建纖維乙醇厭氧發(fā)酵-沼液資源化處理回用耦聯(lián)工藝系統(tǒng)為消除纖維乙醇廢水污染隱患指明了方向．筆者對纖維乙醇廢水回用中的關(guān)鍵問題進行了研究，主要考察了甲酸、乙酸和丙酸對纖維素酶解和乙醇發(fā)酵的影響規(guī)律． 結(jié)果表明:甲酸、乙酸和丙酸對纖維素酶解反應(yīng)的影響主要是酸度的影響，可以通過調(diào)節(jié)酶解液的初始pH 值而消除．甲酸對乙醇發(fā)酵產(chǎn)生抑制的有效抑制濃度為1．6 g/L，乙酸和丙酸對乙醇發(fā)酵產(chǎn)生抑制的有效抑制濃度均為3 g/L．小分子有機酸是厭氧發(fā)酵生產(chǎn)沼氣的重要底物，也是厭氧發(fā)酵的中間產(chǎn)物，因此，控制厭氧沼氣發(fā)酵的穩(wěn)定運行以及降低沼液中殘留的甲酸、乙酸和丙酸的量，是實現(xiàn)纖維乙醇廢水回用的重要前提．

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