郁少林，李宏宇，來文兵，楊 勇，蔡 敏

（廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院骨科，南寧530021）

自20世紀(jì)90年代體外沖擊波（extracorpoporeal shock wave，ESW）用于治療骨不連以來，其療效得到了臨床實(shí)驗(yàn)的證實(shí)［1］。高壓氧（hyperbaric oxygen，HBO）治療有提高氧分壓，增加血氧彌散距離，改善缺氧組織狀態(tài)、改善微循環(huán)等優(yōu)點(diǎn)。研究表明：高壓氧有明顯促進(jìn)成骨細(xì)胞成骨分化，增加骨痂內(nèi)鈣、磷等多種微量元素的水平［2－3］。本文通過將體外沖擊波對骨折端產(chǎn)生的力學(xué)作用和高壓氧促進(jìn)骨生長、改善微循環(huán)的作用結(jié)合對兔橈骨骨折骨不連進(jìn)行治療，取得了滿意效果，為臨床治療骨不連提供了一種良好協(xié)同方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與儀器 標(biāo)準(zhǔn)健康雄性新西蘭實(shí)驗(yàn)大白兔50只，體質(zhì)量3.0～3.5kg，兔齡5～6個月；體外沖擊波碎石機(jī)；動物高壓氧艙；數(shù)碼成像X線機(jī)（DR）；光學(xué)顯微鏡；原子吸收分光光度計等。

1.2 方法

1.2.1 模型制作 麻醉后，參照王旭明等［4］的改良“截骨骨不連模型”，截除雙側(cè)橈骨中段1.0cm（包括骨膜），斷端填塞明膠海綿后，縫合傷口。肌內(nèi)注射青霉素30萬單位，12周后攝X線片，如出現(xiàn)骨折端硬化，斷端間隙存在，髓腔封閉，證實(shí)骨不連模型建立成功，則納入研究。

1.2.2 分組情況 48只實(shí)驗(yàn)動物造模成功，將48只兔子按體質(zhì)量進(jìn)行編號，運(yùn)用隨機(jī)數(shù)字表將實(shí)驗(yàn)動物隨機(jī)分成4組，每組12只，共24條橈骨，A組為體外沖擊波聯(lián)合高壓氧組；B組為單純高壓氧組；C組為體外沖擊波組；D組為完全對照組，不做任何干預(yù)措施。4組實(shí)驗(yàn)動物采用相同的喂養(yǎng)及居住環(huán)境。

1.2.3 體外沖擊波治療 麻醉后將實(shí)驗(yàn)動物固定在體外沖擊波碎石機(jī)上，透視定位后，采用沖擊波焦點(diǎn)能量為0.5mJ/mm2，頻率為70～80次/分，沖擊量為800次，焦點(diǎn)聚焦范圍為1.5cm2，在透視下調(diào)整沖擊焦點(diǎn)，分別對骨折遠(yuǎn)、近端邊緣進(jìn)行沖擊共進(jìn)行兩次。在治療過程中，定時X線透視，以保證焦點(diǎn)準(zhǔn)確的定位。沖擊波治療時間約20min，共進(jìn)行沖擊波治療1次。

1.2.4 高壓氧治療 在動物高壓氧艙進(jìn)行，壓力0.25Mpa（2.5ATA），以循環(huán)封閉方式吸氧，加壓時間為20～30min，穩(wěn)壓時間70min，減壓時間30～35min，1次/天，沖擊波治療后連續(xù)進(jìn)行7d高壓氧治療，此后3周每周進(jìn)行2次高壓氧治療。

1.2.5 X線片檢查 于體外沖擊波治療前及治療后4、8、12周行X線片檢查，主要觀察骨不連區(qū)的間隙距離變化，并在計算機(jī)上精確測量治療前后骨折間隙的平均寬度，采用多點(diǎn)測量取平均值的方法，記錄所獲得的平均值。根據(jù)Perkins公式計算骨痂生成量：骨痂生成量＝2πr1（r2－r1）L。其中r1為治療前骨質(zhì)半徑，r2為治療后的半徑，L為骨痂長度。

1.2.6 光鏡檢查 每個時間點(diǎn)每組處死實(shí)驗(yàn)動物4只（空氣栓塞法），取出骨不連部位（長1.5～2.0cm）組織，生理鹽水沖洗后，置入4%多聚甲醛溶液固定，48h后，置入10%乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）中脫鈣4周，每周更換脫鈣液1次。待標(biāo)本變軟（注射針頭無阻力穿過）后用梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟處理切片，HE染色，4μm連續(xù)切片，HE染色后制作成切片后在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行組織學(xué)觀察，觀察骨痂中成骨細(xì)胞計數(shù)。

1.2.7 骨痂鈣元素水平測定 取骨不連區(qū)部分新生骨痂，濾紙吸干后置入烤箱中進(jìn)行烘干（60℃，48h），稱質(zhì)量后放入到硝酸∶高氯酸（4∶1）溶液中24h，取出標(biāo)本置于電熱板加熱消化至白色液體，然后用去離子水稀釋定容，定容后直接在原子吸收分光光度計上測定鈣元素水平。其計算公式為：鈣元素水平（mg/g）比＝元素水平（mg）/骨痂干質(zhì)量（g）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件，計量資料用±s表示。所得資料不同組間各時間點(diǎn)比較采用單因素方差分析（one－way ANOVA），方差齊的采用 LSD－t檢驗(yàn)比較不同組間差異。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大體觀察 A組達(dá)到骨性愈合，表明平整光滑，顏色亮，質(zhì)地硬，較難掰斷；B、D組未愈合，表現(xiàn)為纖維連接，形成假關(guān)節(jié)，未見明顯的骨痂生成；C組基本達(dá)到愈合，表現(xiàn)為骨皮質(zhì)完整，皮質(zhì)有少量半點(diǎn)，較A組稍薄，有大量骨痂，抗外力稍弱。見圖1。

2.2 X線征觀察 A、C兩組骨不連間隙變化明顯，其中A組變化較C組更為明顯。B、D兩組骨折間隙無明顯改變，骨折斷端仍為硬化骨，骨髓腔封閉，呈現(xiàn)骨不連影像學(xué)改變。見圖2，數(shù)據(jù)比較見表1～2。

圖1 12周時處死兔大體標(biāo)本

圖2 治療后12周X線觀察

表1 各組治療前后不同時間X線檢查骨折間隙變化（±s）

表1 各組治療前后不同時間X線檢查骨折間隙變化（±s）

a：P＜0.05，與A組比較；b：P＜0.05，與B組比較。

組別 治療前（n＝12） 第4周（n＝12） 第8周（n＝8） 第12周（n＝4）5.49±0.91 7.29±0.60 8.36±0.40 9.50±0.36 B組 5.25±0.57 5.45±0.76ab 5.60±0.75ab 5.81±0.76ab C組 5.47±0.78 6.75±0.68a 7.64±0.54a 9.07±0.39a D組 5.57±0.68 5.41±0.74ab 5.44±0.76ab 5.54±0.85 A組ab

表2 治療后骨痂生成量（±s）

表2 治療后骨痂生成量（±s）

a：P＜0.05，與A組比較；b：P＜0.05，與B組比較。

組別 第4周（n＝4） 第8周（n＝4） 第12周（n＝4）27.44±5.18 36.78±5.38 46.5±7.09 B組 6.60±0.44ab 6.91±0.25ab 7.00±0.23ab C組 24.17±3.38a 32.75±3.29a 37.08±6.05a D組 6.42±0.51ab 6.55±0.33ab 6.50±0.14 A組ab

2.3 光鏡檢查 A組4周時骨島形成，骨痂以軟骨骨痂和骨性骨痂為主，可見骨小梁周圍有成骨細(xì)胞，骨小梁增粗；8周骨樣組織逐漸成熟骨化，形成新的骨組織，纖維組織出現(xiàn)鈣化和骨化，骨小梁繼續(xù)增粗增多，可見部分連續(xù)骨小梁（圖3A）；12周，此時骨小梁粗大且致密，連續(xù)性較明顯，可見大量正常骨成分及成骨細(xì)胞。C組4周時可見骨小梁增粗，骨痂以纖維骨痂和軟骨骨痂為主，未見骨性骨痂，骨小梁周圍可見有成骨細(xì)胞，但數(shù)量不及A組；8周可見骨島形成，骨小梁較前增粗，可見少量骨化組織，未見連續(xù)骨小梁（圖3B）；12周時骨小梁數(shù)量明顯增多，但排列不規(guī)則，可見部分呈網(wǎng)絡(luò)狀的骨小梁，骨組織無生長跡象，纖維組織出現(xiàn)骨化現(xiàn)象，A、C兩組各時間點(diǎn)骨痂中鋪上元量水平比較。B、D兩組各時間段所取骨間隙處無明顯骨痂生成，故未進(jìn)行骨痂鈣水平及鈣元素的測定。早期可見炎癥細(xì)胞浸潤，鏡下未見活躍的呈增生狀的成骨細(xì)胞，見較多的成纖維細(xì)胞和排列紊亂的纖維結(jié)締組織。

圖3 治療后8周光鏡觀察情況

表3 A、C兩組各時間點(diǎn)骨痂中鈣元素水平比較（mg/g）

2.4 骨痂鈣元素水平 B、D組無明顯骨痂生成，A、C兩組各時間骨痂中成骨細(xì)胞計數(shù)見表4。

表4 A、C兩組各時間點(diǎn)骨痂中成骨細(xì)胞計數(shù)（±s）

表4 A、C兩組各時間點(diǎn)骨痂中成骨細(xì)胞計數(shù)（±s）

組別 第4周（n＝4） 第8周（n＝4） 第12周（n＝4）72.17±7.47 102.33±6.65 96.67±5.61 C組 55.67±4.63 84.50±7.71 92.50±5.75 t 3.754 9 3.502 4 1.055 0 P A組0.004 7 0.006 4 0.166 0

3 討 論

3.1 骨不連產(chǎn)生原因分析 骨不連發(fā)生率約為5%～50%［5］，其發(fā)生受多種因素的影響，這些因素包括以下幾點(diǎn)。（1）血供因素，骨折的愈合機(jī)制啟動的根本因素在于局部的血液供應(yīng)，Melnyk等［6］研究表明骨折軟組織損傷或過度剝離可明顯增加骨不連的發(fā)生；（2）固定問題：不正確的固定方式及內(nèi)固定術(shù)后不正確的功能鍛煉，可導(dǎo)致內(nèi)固定松動或移位而造成骨不連的發(fā)生［7－8］；（3）感染：感染本身并不能直接導(dǎo)致骨不連的發(fā)生［9］，但感染通過改變骨折端的局部內(nèi)環(huán)境及微生物以及其分泌物對骨及周圍軟組織的直接破壞，是導(dǎo)致骨不連的主要原因；（4）全身因素，如高齡、代謝性疾病、糖尿病、酗酒、營養(yǎng)不良、惡病質(zhì)等因素的存在會延遲骨折愈合，甚至造成骨不連的發(fā)生；（5）早期手術(shù)：潘治軍等［10］對280例骨不連患者進(jìn)行分析得出，早期手術(shù)與骨痂生長能力存在較大相關(guān)性。

3.2 體外沖擊波聯(lián)合高壓氧治療骨不連的意義 高壓氧能加快骨痂生長及骨痂中鈣鹽的沉積，促進(jìn)骨的鈣化［11］。體外沖擊波聯(lián)合高壓氧作用的可能機(jī)制如下。（1）體外沖擊波使骨折斷端產(chǎn)生微骨折，重啟骨折愈合機(jī)制，而高壓氧治療通過增加動脈血和缺氧組織氧分壓梯度而提高骨折處氧供應(yīng)，改善骨折處缺血缺氧環(huán)境，起到加快骨折愈合的作用［12］。（2）促進(jìn)成骨細(xì)胞成骨分化。在本實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)體外沖擊波聯(lián)合高壓氧組的成骨作用明顯強(qiáng)于單純體外沖擊波治療組，光鏡檢查也發(fā)現(xiàn)：聯(lián)合高壓氧組鏡下成骨細(xì)胞數(shù)明顯多于單純體外沖擊組。（3）促進(jìn)某些生長因子的作用。國內(nèi)學(xué)者研究表明高壓氧能促進(jìn)骨折斷面生長因子BMP－2、BMP－7、CD34、VEGF表達(dá)上調(diào)，且VEGF與BMP－2、BMP－7、CD34呈正相關(guān)［13］，這些因子的存在能起到加快新生骨形成作用，促進(jìn)骨折的愈合。（4）減少影響骨折愈合物質(zhì)的產(chǎn)生。研究表明高壓氧治療具有減少血漿中分子物質(zhì)的作用，這些中分子物質(zhì)對組織愈合產(chǎn)生負(fù)面影響［14］。

本研究表明高壓氧對體外沖擊波治療后骨不連部位骨組織生長起到了良好的促進(jìn)作用，提高了體外沖擊波治療骨不連的有效性。沖擊波的作用主要為：造成骨不連兩端的微骨折、打通封閉髓腔、形成血腫，激活骨細(xì)胞的再生，再次啟動骨折的愈合過程。沖擊波治療操作過程中應(yīng)注意：（1）治療前給予足量麻醉劑，以免實(shí)驗(yàn)動物中途蘇醒；（2）固定動物不可過緊，以免造成肢體的缺血壞死；（3）應(yīng)在透視下定位后方可進(jìn)行沖擊波治療。單純高壓氧治療對骨不連無明顯作用；高壓氧的主要協(xié)同作用表現(xiàn)為：（1）改善骨不連部位氧供及血供，改善局部微循環(huán)，促進(jìn)骨折愈合；（2）促進(jìn)骨折端骨痂形成；（3）促進(jìn)骨痂中鈣及其他元素的沉積；（4）促進(jìn)成骨折端成骨細(xì)胞分化。對于使用沖擊波治療的骨不連患者，如果無明顯禁忌證，可以聯(lián)合高壓氧治療來提高療效。

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